CAM-Delam-analysen för att utvärdera cancercellernas metastatiska kapacitet är relativt snabb, enkel och billig. Metoden kan användas för att reda ut de molekylära mekanismer som reglerar metastaseringsbildning och för läkemedelsscreening. En optimerad analys för analys av humana tumörprover kan vara en klinisk metod för personlig cancerbehandling.
Den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall är metastasering (dvs. när cancerceller sprider sig från den primära tumören till avlägsna organ och bildar sekundära tumörer). Delaminering, definierad som nedbrytningen av basallamina och källarmembran, är den initiala processen som underlättar transmigration och spridning av cancerceller till andra vävnader och organ. Att poängsätta cancercellernas delamineringskapacitet skulle indikera den metastatiska potentialen hos dessa celler.
Vi har utvecklat en standardiserad metod, ex ovo CAM-Delam-analysen, för att visualisera och kvantifiera cancercellers förmåga att delaminera och invadera och därigenom kunna bedöma metastatisk aggressivitet. Kortfattat inkluderar CAM-Delam-metoden sådd av cancerceller i silikonringar på chick chorioallantoic membranet (CAM) vid embryonal dag 10, följt av inkubation från timmar till några dagar. CAM-Delam-analysen inkluderar användning av en inre fuktad kammare under inkubation av kycklingembryon. Detta nya tillvägagångssätt ökade embryoöverlevnaden från 10% -50% till 80% -90%, vilket löste tidigare tekniska problem med låg embryoöverlevnad i olika CAM-analyser.
Därefter isolerades, fixerades och frystes CAM-proverna med associerade cancercellkluster. Slutligen visualiserades och analyserades kryostatsektionerade prover för källarmembranskador och cancercellsinvasion med hjälp av immunhistokemi. Genom att utvärdera olika kända metastatiska och icke-metastatiska cancercellinjer utformade för att uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP) visade CAM-Delam kvantitativa resultat att delamineringskapacitetsmönstren återspeglar metastatisk aggressivitet och kan poängsättas i fyra kategorier. Framtida användning av denna analys, förutom att kvantifiera delamineringskapacitet som en indikation på metastatisk aggressivitet, är att avslöja de molekylära mekanismerna som styr delaminering, invasion, bildandet av mikrometastaser och förändringar i tumörmikromiljön.
Cirka 90% av dödligheten hos cancerpatienter orsakas av konsekvenserna av cancermetastaser, vilket är bildandet av sekundära tumörer i andra delar av kroppen varifrån cancern ursprungligen härstammar1. Det är därför av vikt att identifiera metastatiska relaterade mekanismer för att hitta potentiella mål för att undertrycka bildandet av tumörmetastaser. Därefter finns det ett behov av modellsystem där den metastatiska processen kan utvärderas.
Under metastasering genomgår cancerceller epitelial-till-mesenkymal övergång (EMT), en normal cellulär process där epitelceller förlorar sin vidhäftning och polaritetsegenskaper och istället förvärvar en invasiv mesenkymal karaktär2. Delaminering är en del av EMT-processen och involverar nedbrytning av laminin i källarmembranet, vilket är en förutsättning för cancerceller att lämna den primära tumören och invadera andra vävnader. De viktigaste faktorerna som uppregleras under metastaseringsbildning inkluderar matrismetalloproteinaser (MMP), ADAM (ett disintergin och metalloproteinas), ADAMTS (ADAM med trombospondinmotiv) och MMP av membrantyp (MT-MMP)3,4. Dessa faktorer bryter ner molekyler som laminin, som uttrycks i alla källarmembran, för att underlätta cellmigration och invasion.
Det korioallantoiska membranet (CAM) hos ett befruktat kycklingägg är en typ av källarmembran. Befruktade kycklingägg har använts som metastatiska modeller, där cancerceller har såtts på den extraembryoniska CAM och senare metastaseringsbildning som observerats i kycklingembryon5. Dessutom används ofta in vivo musmetastatiska modeller, där cancerceller implanteras i mössen och metastaser i olika organ analyseras6. Detta tillvägagångssätt är tidskrävande, dyrt och kan orsaka obehag för djuren. För att ta itu med detta har vi utvecklat CAM-Delam-analysen, en snabbare och billigare modell för att utvärdera cancercellernas metastatiska aggressivitet. I denna modell kombineras cancercellernas förmåga att bryta ner kycklingen CAM (t.ex. delamineringskapaciteten) med potentiell cancercellsinvasion i mesenkymet och används som ett mått på metastatisk aggressivitet.
Den här artikeln, baserad på en tidigare publikation7, beskriver CAM-Delam-analysen i detalj, från hantering av befruktade kycklingägg, cancercellodling och sådd, dissektion och analyser av CAM-prover, till poängsättning av cancercellernas delamineringskapacitet i fyra kategorier: intakt, förändrad, skadad och invasion. Vi ger också exempel på hur denna analys kan användas för att bestämma de molekylära mekanismer som reglerar delamineringsprocessen.
Detta papper beskriver CAM-Delam-analysen för att utvärdera cancercellernas metastatiska aggressivitet, bestämd genom att göra basala lamina-modulationer och potentiell cellinvasion i mesenkymet inom en period av timmar till några dagar. Ett tidigare tekniskt problem för olika CAM-analyser har varit den låga överlevnaden av kycklingembryon. Denna fråga löstes genom att införa användningen av en inre fuktad kammare under embryoinkubation, vilket ökade embryoöverlevnaden från 10% -50% till 80% -90%7. Användningen av en inre fuktad kammare kan därför vara värdefull i CAM-analyser i allmänhet, liksom i andra ex ovo chick-experiment.
De presenterade poängtidspunkterna vid 14 timmar, 1,5 dagar, 2,5 dagar och 3,5 dagar efter sådd av 1 x 106 cancerceller på CAM är baserade på rigorös metodutveckling med sex olika cancercellinjer och är tillräckliga för att skilja intervallet från icke-delaminering till delaminering med invasionskapacitet hos cancercellinjer. En minsta användning av fyra ägg med tre ringar i varje per tidpunkt och per cellinje föreslås, och detta bör upprepas minst en gång eller enligt experimentella mönster och statistiska krav. En fördel med CAM-Delam-analysen är att få informativa resultat angående cancercellernas delamineringskapacitet inom några dagar för att uppskatta cancercellernas aggressivitet och potentiella risk för metastaseringsbildning. Den snabba leveransen av resultat underlättas genom att övervaka nedbrytningen av basallamina på grund av de invaderande cancercellerna och de efterföljande mikrotumörerna / tumörknopparna och organmetastaserna. Traditionellt har CAM-modeller använts för att analysera bildandet av organmetastaser, vilket tar cirka 2 veckor att bestämma9. Genom att använda sju olika cancercellinjer har vi tidigare verifierat7 att delamineringspoängen är kopplad till cancercellernas förmåga att bilda metastaser i gnagarmodellerna10,11,12,13,14, vilket stöder det prediktiva värdet av CAM-Delam-analysen. Dessutom kräver musmodeller en ännu längre tid, flera veckor upp till månader, innan metastaser kan undersökas15,16. I korthet är denna utvecklade CAM-Delam-analys, fokuserad på att poängsätta delamineringskapacitet och inte på att undersöka senare tumörbildning i kycklingembryomet, därför ett bra komplement till befintliga kyckling CAM-invasions- och mustumörmodeller.
En begränsning i CAM-Delam-analysen kan vara den oklara visualiseringen av basallamina om cancercellerna själva uttrycker laminin. Om så är fallet kan andra markörer som indikerar basallamina, såsom E-cadherin, användas7. Andra CAM-invasionsstudier har använt kollagen av typ IV för att visualisera CAM och pan-cytokeratin och vimentin för att identifiera invaderande cancerceller och bildandet av mikrotumörer / tumörknoppar17,18.
Delaminering är en normal cellulär process, både under utveckling och senare i livet, vilket gör det möjligt för celler att lämna ett epitel och migrera till andra vävnader. Exempel på delaminerande celler under utveckling är neuralkam och olfaktoriska banbrytande nervceller19,20; senare i livet är sårläkning beroende av delaminering21. Under cancer, denna process är uppreglerad i fel celler och / eller vid fel tidpunkt. Cam-Delam-metoden kan således vara till nytta för att reda ut de molekylära mekanismer som reglerar delaminering, vilket skulle vara av betydelse för både grundläggande biologisk kunskap och sjukdomskunskap. Sådana delamineringsstudier skulle inkludera att lägga till faktorer av intresse för cancercellerna som utsädes på CAM eller studera genetiskt modifierade cancerceller. Ett exempel som presenteras här är CoCl 2-förbehandling av den icke-metastatiska cellinjen U251 för att inducera hypoxi, vilket leder till induktion av en metastatisk aggressiv kapacitet som kan undertryckas av en bredspektrum MMP-hämmare. Att hitta nyckelmolekyler som styr delaminering ökar således möjligheten att utforma hämmare för att undertrycka denna process. I förhållande till detta är en annan potentiell användning för CAM-Delam-protokollet vid läkemedelsscreening för undertryckande av delaminering och cellinvasion. Dessutom är utvärderingen av cancerns svårighetsgrad i kliniken en kritisk komponent för diagnos, planering av behandling och vård. För närvarande är TNM-staging-systemet (T, tumörstorlek; N, nod-om cancern har spridit sig till lymfkörtlarna; M, avlägsen metastasering) används för att utvärdera svårighetsgraden av cancer22. CAM-Delam-analysen definierar ett innovativt tillvägagångssätt för att utvärdera cancercellernas aggressivitet och potentiell risk för metastasering och kan vara ett användbart komplement till TNM-system. Anmärkningsvärt är att TNM-staging baseras på analyser av fasta vävnadsprover, medan en potentiell klinisk CAM-Delam-metod skulle undersöka färsk eller färskfryst vävnad i kombination med tekniker för att återuppliva frysta celler23.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar följande forskare vid Umeå universitet för deras hjälp med relevanta cancercellinjer och antikroppar: L. Carlsson (von Willebrand Factor-antikropp), J. Gilthorpe (U251) och M. Landström (PC-3U). Vi tackar också Hauke Holthusen i Gilthorpe-labbet för genereringen av den stabila cellinjen HEK293-TLR-AAVS1. Arbetet i Gunhagalaboratoriet stöddes av Cancerfonden (18 0463), Umeå Biotech Incubator, Norrlands Cancerforskningsfond, Vetenskapsrådet (2017-01430) och Medicinska fakulteten vid Umeå universitet.
EQUIPMENT | |||
Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
MATERIALS | |||
anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
Plastic box | Esclain | ||
PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
SOLUTIONS | |||
Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
Mix and use immediately | |||
Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
FBS 50 mL |
|||
Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
Store at 4 °C | |||
PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
Store in RT | |||
PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
0.2 M PB 50 mL |
|||
Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
heat to 60 °C in water bath | |||
add 5 M NaOH 25 µL |
|||
Stir to dissolve the PFA powder | |||
Store at 4 °C | |||
TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
150mM NaCI 30 mL |
|||
0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
H2O (MQ) 900 mL |
|||
Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
10 mL in total, Store at 4 °C |