CAM-Delam-analysen for å evaluere den metastatiske kapasiteten til kreftceller er relativt rask, enkel og billig. Metoden kan brukes til å avdekke molekylære mekanismer som regulerer metastasedannelse og for legemiddelscreening. En optimalisert analyse for å analysere menneskelige tumorprøver kan være en klinisk metode for personlig kreftbehandling.
Hovedårsaken til kreftrelaterte dødsfall er metastasedannelse (dvs. når kreftceller sprer seg fra primærsvulsten til fjerne organer og danner sekundære svulster). Delaminering, definert som nedbrytning av basal lamina og kjellermembran, er den første prosessen som letter transmigrasjon og spredning av kreftceller til andre vev og organer. Å skåre delamineringskapasiteten til kreftceller vil indikere det metastatiske potensialet til disse cellene.
Vi har utviklet en standardisert metode, ex ovo CAM-Delam-analysen, for å visualisere og kvantifisere kreftcellenes evne til å delaminere og invadere, og dermed kunne vurdere metastatisk aggressivitet. Kort sagt inkluderer CAM-Delam-metoden såing av kreftceller i silikonringer på kylling chorioallantoic membranen (CAM) på embryonal dag 10, etterfulgt av inkubasjon fra timer til noen dager. CAM-Delam-analysen inkluderer bruk av et internt fuktet kammer under kyllingembryoinkubasjon. Denne nye tilnærmingen økte embryooverlevelsen fra 10% -50% til 80% -90%, som løste tidligere tekniske problemer med lave embryooverlevelsesrater i forskjellige CAM-analyser.
Deretter ble CAM-prøvene med tilhørende kreftcelleklynger isolert, fikset og frosset. Til slutt ble kryostat-seksjonerte prøver visualisert og analysert for kjellermembranskader og kreftcelleinvasjon ved hjelp av immunhiokjemi. Ved å evaluere ulike kjente metastatiske og ikke-metastatiske kreftcellelinjer designet for å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP), viste CAM-Delam kvantitative resultater at delamineringskapasitetsmønstrene reflekterer metastatisk aggressivitet og kan scores i fire kategorier. Fremtidig bruk av denne analysen, bortsett fra kvantifisering av delamineringskapasitet som en indikasjon på metastatisk aggressivitet, er å avdekke de molekylære mekanismene som kontrollerer delaminering, invasjon, dannelse av mikrometastaser og endringer i tumormikromiljøet.
Omtrent 90% av dødeligheten hos kreftpasienter skyldes konsekvensene av kreftmetastase, som er dannelsen av sekundære svulster i andre deler av kroppen hvor kreften opprinnelig stammer fra1. Det er derfor viktig å identifisere metastatiske relaterte mekanismer for å finne potensielle mål for å undertrykke dannelsen av tumormetastaser. Deretter er det behov for modellsystemer der den metastatiske prosessen kan evalueres.
Under metastase gjennomgår kreftceller epitelial-til-mesenchymal overgang (EMT), en normal cellulær prosess der epitelceller mister sin overholdelse og polaritetsegenskaper og i stedet får en invasiv mesenchymal karakter2. Delaminering er en del av EMT-prosessen og innebærer nedbrytning av laminin i kjellermembranen, noe som er en forutsetning for at kreftceller skal forlate den primære svulsten og invadere andre vev. De viktigste faktorene som er oppregulert under metastasedannelse inkluderer matrisemetalloproteinaser (MMPer), ADAM (en disintergin og metalloproteinase), ADAMTS (ADAM med trombospondinmotiver) og membran-type MMPs (MT-MMPs)3,4. Disse faktorene forringer molekyler som laminin, som uttrykkes i alle kjellermembraner, for å lette cellemigrasjon og invasjon.
Den chorioallantoic membranen (CAM) av et befruktet kyllingegg er en type kjellermembran. Befruktede kyllingegg har blitt brukt som metastatiske modeller, der kreftceller har blitt sådd på den ekstraembryoniske CAM og senere metastasedannelse observert i kyllingembryoene5. Videre brukes in vivo mus metastatiske modeller ofte, hvor kreftceller implanteres i musene og metastaser i ulike organer analyseres6. Denne tilnærmingen er tidkrevende, dyr og kan forårsake ubehag for dyrene. For å løse dette har vi utviklet CAM-Delam-analysen, en raskere og billigere modell for å evaluere den metastatiske aggressiviteten til kreftceller. I denne modellen kombineres kreftcellenes evne til å forringe kyllingkameraet (f.eks. delamineringskapasiteten) med potensiell kreftcelleinvasjon i mesenchymet og brukes som måling av metastatisk aggressivitet.
Den nåværende artikkelen, basert på en tidligere publikasjon7, beskriver CAM-Delam-analysen i detalj, fra befruktet kyllingegghåndtering, kreftcellekultur og såing, avhandling og analyser av CAM-prøver, til skåring av delamineringskapasiteten til kreftceller i fire kategorier: intakt, endret, skadet og invasjon. Vi gir også eksempler på hvordan denne analysen kan brukes til å bestemme molekylære mekanismer som regulerer delamineringsprosessen.
Denne artikkelen beskriver CAM-Delam-analysen for å evaluere den metastatiske aggressiviteten til kreftceller, bestemt av å score basale laminamoduleringer og potensiell celleinvasjon i mesenchymet innen en periode på timer til noen dager. Et tidligere teknisk problem for ulike CAM-analyser har vært den lave overlevelsen av kyllingembryoer. Dette problemet ble løst ved å introdusere bruken av et internt fuktet kammer under embryoinkubasjon, noe som økte embryooverlevelsen fra 10% -50% til 80% -90%7. Bruken av et internt fuktet kammer kan derfor være verdifullt i CAM-analyser generelt, så vel som i andre ex ovo chick eksperimenter.
Den presenterte scoringstidspoengene på 14 timer, 1,5 dager, 2,5 dager og 3,5 dager etter sådd 1 x 106 kreftceller på CAM er basert på streng metodeutvikling ved hjelp av seks forskjellige kreftcellelinjer og er tilstrekkelige til å skille området fra ikke-delaminerende til deaminerende-med-invasjonskapasitet av kreftcellelinjer. En minimumsbruk av fire egg med tre ringer i hver per tidspunkt og per cellelinje foreslås, og dette bør gjentas minst en gang eller i henhold til eksperimentelle design og statistiske krav. En fordel med CAM-Delam-analysen er å oppnå informative resultater angående delamineringskapasiteten til kreftceller innen få dager for å estimere aggressiviteten til kreftceller og potensiell risiko for metastasedannelse. Rask levering av resultater forenkles ved å overvåke nedbrytningen av basal lamina på grunn av de invaderende kreftcellene og de påfølgende mikrotumorene / tumorknoppene og organmetastasene. Tradisjonelt har CAM-modeller blitt brukt til å analysere dannelsen av organmetastaser, noe som tar rundt 2 uker å bli bestemt9. Ved å bruke syv forskjellige kreftcellelinjer har vi tidligere bekreftet7 at delamineringsscoring er knyttet til kreftcellenes evne til å danne metastaser i gnagermodeller 10,11,12,13,14, som støtter den prediktive verdien av CAM-Delam-analysen. Videre krever musemodeller en enda lengre tid, flere uker opp til måneder, før metastaser kan undersøkes15,16. Kort sagt, denne utviklede CAM-Delam-analysen, fokusert på å score delamineringskapasitet og ikke på å undersøke senere tumordannelse i kyllingembryoet, er derfor et godt supplement til eksisterende kylling CAM-invasjon og musesvulstmodeller.
En begrensning i CAM-Delam-analysen kan være den uklare visualiseringen av basal lamina hvis kreftcellene selv uttrykker laminin. I så fall kan andre markører som indikerer basal lamina, for eksempel E-kadherin, brukes7. Andre CAM-invasjonsstudier har brukt type IV kollagen for å visualisere CAM og pan-cytokeratin og vimentin for å identifisere invaderende kreftceller og dannelsen av mikrotumorer / tumorknopper17,18.
Delaminering er en normal cellulær prosess, både under utvikling og senere i livet, noe som gjør det mulig for celler å forlate et epitel og migrere til andre vev. Eksempler på delaminerende celler under utvikling er nevral kam og olfaktoriske banebrytende nevroner 19,20; Senere i livet er sårheling avhengig av delaminering21. Under kreft er denne prosessen oppregulert i feil celler og / eller til feil tid. Dermed kan CAM-Delam-metoden være til nytte for å avdekke de molekylære mekanismene som regulerer delaminering, noe som vil være av betydning for både grunnleggende biologisk og sykdomskunnskap. Slike delamineringsstudier vil omfatte å legge til faktorer av interesse for kreftcellene som er sådd på CAM eller studere genetisk modifiserte kreftceller. Et eksempel som presenteres her er CoCl 2-forbehandling av den ikke-metastatiske cellelinjen U251 for å indusere hypoksi, noe som fører til induksjon av en metastatisk aggressiv kapasitet som kan undertrykkes av en bredspektret MMP-hemmer. Dermed øker det muligheten for å designe inhibitorer for å undertrykke denne prosessen ved å finne viktige molekyler som kontrollerer delaminering. I forhold til dette er en annen potensiell bruk for CAM-Delam-protokollen i narkotikascreening for undertrykkelse av delaminering og celleinvasjon. Videre er evalueringen av kreft alvorlighetsgrad en kritisk komponent for diagnose, planleggingsbehandling og omsorg på klinikken. For tiden er TNM-iscenesettelsessystemet (T, tumorstørrelse; N, node-om kreften har spredt seg til lymfeknuter; M, fjern metastase) brukes til å evaluere alvorlighetsgraden av kreft22. CAM-Delam-analysen definerer en innovativ tilnærming for å evaluere aggressiviteten til kreftceller og potensiell risiko for metastaserdannelse og kan være et nyttig supplement til TNM-iscenesettelsessystemet. Bemerkelsesverdig er at TNM iscenesettelse er basert på analyser av faste vevsprøver, mens en potensiell klinisk CAM-Delam-tilnærming vil undersøke friskt eller ferskfryst vev i kombinasjon med teknikker for å gjenopplive frosne celler23.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker følgende forskere ved Umeå Universitet for deres hjelp med relevante kreftcellelinjer og antistoffer: L. Carlsson (von Willebrand Factor antistoff), J. Gilthorpe (U251) og M. Landström (PC-3U). Vi takker også Hauke Holthusen i Gilthorpe-laboratoriet for genereringen av hek293-TLR-AAVS1 stabil cellelinje. Arbeidet i Gunhaga-laboratoriet ble støttet av Den svenske kreftstiftelsen (18 0463), Umeå Biotech Incubator, Norrlands Cancerforskningsfond, Det svenske forskningsrådet (2017-01430) og Det medisinske fakultet ved Umeå Universitet.
EQUIPMENT | |||
Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
MATERIALS | |||
anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
Plastic box | Esclain | ||
PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
SOLUTIONS | |||
Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
Mix and use immediately | |||
Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
FBS 50 mL |
|||
Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
Store at 4 °C | |||
PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
Store in RT | |||
PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
0.2 M PB 50 mL |
|||
Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
heat to 60 °C in water bath | |||
add 5 M NaOH 25 µL |
|||
Stir to dissolve the PFA powder | |||
Store at 4 °C | |||
TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
150mM NaCI 30 mL |
|||
0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
H2O (MQ) 900 mL |
|||
Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
10 mL in total, Store at 4 °C |