Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro Rekonstituering av aktincytoskjelettet inne i gigantiske unilamellære vesikler

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64026
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Summary

I dette manuskriptet demonstrerer vi eksperimentelle teknikker for å innkapsle F-aktincytoskelettet i gigantiske unilamellære lipidvesikler (også kalt liposomer), og metoden for å danne et cortex-biomimicking F-aktinlag ved den indre brosjyren av liposommembranen.

Abstract

Aktincytoskelettet, det viktigste mekaniske maskineriet i cellen, formidler mange viktige fysiske cellulære aktiviteter, inkludert celledeformasjon, deling, migrasjon og adhesjon. Imidlertid er studiet av dynamikken og strukturen til aktinnettverket in vivo komplisert av den biokjemiske og genetiske reguleringen i levende celler. For å bygge en minimal modell uten intracellulær biokjemisk regulering, er aktin innkapslet i gigantiske unilamellære vesikler (GUV, også kalt liposomer). De biomimetiske liposomene er i cellestørrelse og muliggjør en kvantitativ innsikt i de mekaniske og dynamiske egenskapene til cytoskelettnettverket, og åpner en levedyktig rute for bottom-up syntetisk biologi. For å generere liposomer for innkapsling, benyttes den inverterte emulsjonsmetoden (også referert til som emulsjonsoverføringsmetoden), som er en av de mest vellykkede teknikkene for innkapsling av komplekse løsninger i liposomer for å fremstille forskjellige cellelignende systemer. Med denne metoden tilsettes en blanding av proteiner av interesse til den indre bufferen, som senere emulgeres i en fosfolipidholdig mineraloljeløsning for å danne monolags lipiddråper. De ønskede liposomene genereres fra monolags lipiddråper som krysser et lipid / olje-vann-grensesnitt. Denne metoden muliggjør innkapsling av konsentrerte aktinpolymerer i liposomene med ønskede lipidkomponenter, og baner vei for in vitro rekonstituering av et biomimicking cytoskjelettnettverk.

Introduction

Aktincytoskelettet spiller en grunnleggende rolle i konstruksjonen av cellens intracellulære arkitektur ved å koordinere kontraktilitet på molekylært nivå og kraftgenerering 1,2,3. Som et resultat formidler den mange viktige cellulære aktiviteter, inkludert celledeformasjon4,5, divisjon6, migrasjon 7,8 og vedheft9. In vitro-rekonstitueringen av actin-nettverk har fått enorm oppmerksomhet de siste årene 10,11,12,13,14,15,16,17. Målet med rekonstituering er å bygge en minimal modell av cellen uten den komplekse biokjemiske reguleringen som eksisterer i levende celler. Dette gir et kontrollerbart miljø for å undersøke spesifikke intracellulære aktiviteter og letter identifisering og analyse av forskjellige komponenter i aktincytoskelettet18,19. Videre gir innkapslingen av in vitro aktinnettverk inne i fosfolipid gigantiske unilamellære vesikler (GUV, liposomer) et begrenset, men deformerbart rom med en semi-permeabel grense. Det etterligner det fysiologiske og mekaniske mikromiljøet til aktinmaskineriet i cellen 9,20,21,22.

Blant ulike metoder for å forberede liposomer er lipidfilmhydreringsmetoden (også kjent som hevelsesmetoden) en av de tidligste teknikkene23. Den tørre lipidfilmen hydrerer med tilsetning av buffere, og danner membranøse bobler som til slutt blir vesikler24. For å produsere større vesikler med høyere utbytte, bruker en forbedret metode som går videre fra filmhydreringsmetoden, kjent som elektroformasjonsmetoden25, et AC-elektrisk felt for effektivt å fremme hydreringsprosessen26. De viktigste begrensningene ved disse hydreringsbaserte metodene for aktininnkapsling er at den har lav innkapslingseffektivitet av høyt konsentrerte proteiner, og den er bare kompatibel med spesifikke lipidsammensetninger24. Den inverterte emulsjonsteknikken har til sammenligning færre begrensninger for lipidkomponenter og proteinkonsentrasjoner20,27,28,29. I denne metoden tilsettes en blanding av proteiner for innkapsling til den indre vandige bufferen, som senere emulgeres i en lipidholdig mineraloljeløsning, og danner lipid-monolagsdråper. Monolags lipiddråper krysser deretter gjennom et annet lipid / olje-vanngrensesnitt gjennom sentrifugering for å danne dobbeltlags lipidvesikler (liposomer). Denne teknikken har vist seg å være en av de mest vellykkede strategiene for aktininnkapsling24,30. Separat er det noen mikrofluidiske enhetsmetoder, inkludert pulserende spyling 31,32, forbigående membranutkast33 og cDICE-metoden34. Likhetene mellom den inverterte emulsjonsmetoden og den mikrofluidiske metoden er lipidløsningsmidlet (olje) som benyttes og innføringen av lipid / olje-vann-grensesnitt for dannelsen av den ytre brosjyren av liposomer. Derimot krever genereringen av liposomer ved den mikrofluidiske metoden et oppsett av mikrofluidiske enheter og ledsages av olje fanget mellom de to brosjyrene i dobbeltlaget, noe som krever et ekstra trinn for oljefjerning35.

I dette manuskriptet brukte vi den inverterte emulsjonsteknikken for å fremstille liposomer som innkapsler et polymerisert F-aktinnettverk som tidligere brukt22. Proteinblandingen for innkapsling ble først plassert i en buffer med ikke-polymeriserende forhold for å opprettholde aktin i sin kuleformede (G) form. Hele prosessen ble utført ved 4 °C for å forhindre tidlig aktinpolymerisering, som senere ble utløst ved å la prøven varmes opp til romtemperatur. En gang ved romtemperatur polymeriserer aktinet til sin filamentøse (F) form. En rekke aktinbindende proteiner kan tilsettes den indre vandige bufferløsningen for å studere proteinfunksjoner og egenskaper, og dermed gi ytterligere innsikt i samspillet med aktinnettverket og membranoverflaten. Denne metoden kan også brukes til innkapsling av forskjellige proteiner av interesse36 og store gjenstander (mikropartikler, selvdrevne mikroswimmere, etc.) nær størrelsen på de endelige liposomene 28,37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av buffere og proteinløsninger

  1. Forbered den vandige indre ikke-polymerisasjonsbufferen (INP) i et totalt volum på 5 ml ved å blande 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sukrose og0,2 mM ATP.
  2. Forbered proteinblandingen (PM) ved å tilsette proteiner til INP-bufferen ved 4 °C med følgende konsentrasjoner: 11,2 μM ikke-fluorescerende G-aktin, 2,8 μM fluorescerende merket aktin og 0,24 μM Arp2/3 (materialtabell). For å danne et F-aktinlag, tilsett 100 nM gelsolin, 4 μM cofilin og 2,2 μM VCA-His til PM. Som et kontrolleksperiment, erstatt PM med 100 μg / ml fluorescerende fargestoff (Table of Materials).
  3. Forbered den vandige indre polymerisasjonsbufferen (IP) (vandig) i et totalt volum på 5 ml ved å blande 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP og 80 mM sukrose.
  4. Forbered den endelige bufferen (FB) ved å blande UPP-buffer (som inneholder PM) og IP-buffer i et volumforhold på 1:1 for å gi den indre vandige løsningen i et totalt volum på 30 μL som vil bli innkapslet i liposomet.
  5. Forbered den vandige utvendige bufferen (OB) i et totalt volum på 150 μL ved å blande 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glukose og 0,1 mg / ml β-kasein.
    MERK: Osmolariteten til OB kan justeres med glukose for å sikre at det osmotiske trykket til OB er litt større enn FB (20-60 mOsm). Tettheten til FB bør være litt høyere enn OB.

2. Fremstilling av liposomer basert på inverterte emulsjonsteknikker

  1. Forbered lipid-oljeblandingen
    1. Tilsett 100 μL 25 mg / ml L-α-fosfatidylkolin (ikke-fluorescerende Egg PC, også kalt EPC, inkludert 1% DHPE) i et glassflaske. Fordamp kloroform med argongass, og etterlat en tørr, fast lipidfilm (2,5 mg) i bunnen av hetteglasset.
      1. For å danne et F-aktinlag, tilsett 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-karboksypentyl) iminodiacetic acid] succinyl} nikkelsalt (DOGS-NTA-Ni) i forholdet 10:1 mellom EPC og DOGS-NTA-Ni og bland før fordampning av kloroform.
    2. Tilsett 2 ml mineralolje og sonikere lipidoljeblandingen ved romtemperatur i et bad i 1 time for å suspendere lipidene igjen.
      MERK: Lipid-oljeblandingen etter sonikering kan holdes i 1 uke ved 4 ° C. Re-sonikering foreslås før bruk.
  2. Forbered en endelig buffer i olje (FB / olje) emulsjon for fremstilling av monolags lipiddråper som inneholder proteinet av interesse.
    1. Til 100 μL lipidoljeblanding tatt i et plastrør, tilsett 10 μL FB. Forsikre deg om at FB er i ett dråpe.
    2. Bruk en glasssprøyte til å trekke lipid-olje-FB-blandingen og aspirer forsiktig opp og ned flere ganger for å emulgere den; trekk først en liten mengde lipidoljeblanding, og deretter FB-dråpen ved å plassere sprøytespissen i periferien av dråpen for å bryte den opp i små dråper. Gjenta opp og ned aspirasjonen til en hvitaktig og uklar emulsjon dannes.
  3. Sett 30 μL OB i et separat plastrør. Plasser 30 μL av lipid-oljeblandingen på toppen av OB og la den sitte i ~ 10 minutter for å utvikle et lipidmonolag ved grensesnittet.
    MERK: Hvis lipidene er ladet eller proteinet er innlemmet, bør varigheten av dette trinnet forlenges38.
  4. Forbered liposomene
    1. Tilsett forsiktig 50 μL av FB/oljeemulsjonen (trinn 2.2) til den øverste oljefasen av røret fra trinn 2.3.
    2. Sentrifuge plastrøret ved 100 x g i 15 minutter ved 4 °C. Varier tid og sentrifugeringshastighet for å optimalisere for liposomdannelse.
      MERK: Etter sentrifugering skal den øverste oljefasen være klar, og den nederste OB (som inneholder liposomer) skal være litt uklar.
    3. Fjern oljefasen forsiktig bort med pipette. Aspirer ekstra volum om nødvendig. Pass på at pipettespissen ikke legges på siden av røret for å unngå å lage en menisk olje på toppen av liposomfasen.
    4. Med en ny pipette stikker du pipettespissen sakte inn i den gjenværende bunnfasen og aspirerer det vandige volumet for å samle liposomer.
      MERK: Det er bedre å miste volum enn å innlemme oljen. Inkluderingen av olje vil føre til at liposomer brister, og de interne komponentene vil bli frigjort i den eksterne bufferen. Klipp spissen av en pipette for å redusere skjær.

3. Mikroskopi observasjon

  1. Hell 100 μL OB i brønnen til et inkubasjonskammer (4-brønnsplate som inneholder 12 mm runde deksler). Deponer forsiktig de innsamlede liposomene (trinn 2.4.4) i OB, og legg deretter en annen deksel på toppen av kammeret.
    MERK: OB inneholder β-kasein for å passivisere glassoverflaten og minimere stikk mellom liposomene20.
  2. Observer liposomer med et konfokalt mikroskop ved hjelp av et 63x olje-nedsenkningsmål. Bruk 488 nm, 647 nm og 561 nm laserlinjer for å observere henholdsvis fluorescerende merket lipid, innkapslet fluorescerende fargestoff og innkapslet fluorescerende merket aktin. Ta bilder av interesse og lagre bildene i TIFF-format.
  3. Behandle og analysere bilder i ImageJ/Fiji39. For nye brukere av ImageJ/Fiji er en online opplæring tilgjengelig (se Materialfortegnelse).
    1. Åpne TIFF-filen ved hjelp av ImageJ / Fiji-programvaren.
    2. Gå til bilde > juster > lysstyrke / kontrast. Juster lysstyrken og kontrasten til bildet til ønsket skala ved å justere minimums- og maksimumsinnstillingene, samt lysstyrke- og kontrastskyvekontrollene.
    3. Klikk på rektangelvalgverktøyet på verktøylinjen og velg interesseområdet (ROI). Gå til Bilde > Beskjær for å beskjære avkastningen.
    4. Gå til Analyser > angitt skala. I popup-vinduet skriver du inn 1.0 i feltet Pixel Aspect Ratio og angir μm som Lengdeenhet. I feltet Avstand i piksler angir du bildebredden i piksler . I feltet Kjent avstand skriver du inn den virkelige bildebredden i mikron.
    5. For å måle størrelsen på liposomet, Bruk det ovale markeringsverktøyet på verktøylinjen til å tegne en sirkel langs kanten av liposomet. Gå til Analyser > Mål for å måle området av sirkelen, hvorfra liposomets diameter kan beregnes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremstillingen av liposomer basert på den omvendte emulsjonsteknikken er illustrert grafisk og skjematisk i figur 1.

Først ble tomme (bare) liposomer (~ 5-50 μm i diameter) som var sammensatt av fosfolipid (EPC) og fluorescerende lipid (DHPE) fremstilt. Et lyst, langt rødt fluorescerende fargestoff ble innkapslet i nakne liposomer som et kontrolleksperiment. Hvorvidt et lipidmonolag har blitt dannet i periferien av dråpen, kan bestemmes ved å observere monolags lipiddråper som inneholder fluorescerende fargestoff i emulsjonen, som vist i figur 2A. Vellykket liposomgenerering kan verifiseres gjennom visualisering av den tynne sirkulære ringen, som er det grønnfluorescerende lipid-dobbeltlaget (konjugering av lipider med DHPE), under 488 nm laser ved bruk av konfokal mikroskopi (figur 2A, høyre panel). For å bekrefte innkapsling av det fluorescerende fargestoffet, bør det indre miljøet til liposomene være jevnt fluorescerende under en 647 nm laser (figur 2A; overleggsbilde) på grunn av det langt røde fluorescerende fargestoffet (materialtabell).

Ulike former for innkapslet aktin inne i monolags lipiddråpen er vist i figur 2B. Bilder fra venstre til høyre viser kuleformet aktin (G-aktin), filamentøst aktin (F-aktin), aktin som danner et tynt F-aktinlag med tilsetning av VCA-His til den endelige bufferen og nikkel-lipid til membranen, og aktin som danner et tynt F-aktinlag med tilsetning av VCA-His, cofilin og gelsolin til den endelige bufferen og nikkel-lipid til membranen.

Deretter ble renset G-aktin og tilhørende F-aktinbindende proteiner innkapslet i liposomet. Sammensatt av de samme membrankomponentene som ovenfor (EPC blandet med DHPE), var liposomer her ~ 5-50 μm i diameter. Dannelsen av liposomer kan visualiseres med de tynne grønne sirkulære ringene vist i figur 3A, B. Aktinpolymerisasjon ble utløst ved å la prøven varmes opp til romtemperatur. Som vist i figur 3A er de rekonstituerte F-aktinnettverkene (med 20% fluorescerende merket aktin) inne i liposomer heterogene, og manifesterer seg som forgrenede nettverksstrukturer av aktinfilamenter. Den forgrenede arkitekturen ble utløst av introduksjonen av Arp2/3-komplekset, som samtidig styrer kjernedannelsen og forgreningen av aktinfilamenter, sammen med VCA-His 40,41,42,43,44,45.

Til slutt ble et F-aktin cortex-biomimicking system opprettet. Et tynt, men tett forgrenet F-aktinlag ble opprettet ved den indre brosjyren av dobbeltlaget av liposomer22, som kunne visualiseres som et fluorescerende skall (figur 3C). I dette tilfellet ble i tillegg VCA-His, cofilin og gelsolin innkapslet i liposomer. Nikkellipider var nødvendige i komponenten av lipidmembranen. VCA-His, et WASP-fragment, bærer en histidin-tag i samspill med nikkellipidene i lipidmembranen. I mellomtiden rekrutterer den Arp2/3-komplekset 20,46,47,48. Som et resultat genererer aktin nukleert av Arp2 / 3-komplekset et F-aktinlag belagt langs det indre laget av membranen i nærvær av cofilin og gelsolin.

Figure 1
Figur 1: Fremstilling av liposomer basert på invertert emulsjonsteknikk. (A) Liposompreparat består av to trinn. Trinn en: En dråpe på 10 μL Final Buffer (FB) som bærer proteiner av interesse ble tilsatt til 100 μL av fosfolipid-oljeblandingen i forholdet 1:10 og suspendert ved forsiktig aspirering opp og ned med en glasssprøyte. Oppløsninger som inneholdt monolags lipiddråper ble hvite etter frem og tilbake aspirasjon. Trinn to: I et separat plastrør ble noen få mikroliter av lipidoljeblandingen plassert på toppen av samme mengde OB og tillatt å sitte i ~ 10 minutter for å utvikle et lipidmonolag ved OB / oljegrensesnitt. Emulsjonen fra trinn én ble helt oppå oljefasen fra trinn to og ble sentrifugert (100 x g; 15 minutter) ved 4 °C. Etter sentrifugering skal den øverste oljeoppløsningen være klar, og den nederste OB-løsningen (som inneholder liposomer) skal være litt uklar. (B) Skjemaer av liposompreparatet fra en omvendt emulsjon. Den hvite emulsjonen på toppen inneholdt monolags lipiddråper som innlemmet et forgrenet aktinnettverk inne. Under sentrifugering passerte monolags lipiddråper gjennom OB / oljegrensesnittet for å danne en ytre brosjyre slik at liposomer ble opprettet og akkumulert i bunnen av plastrøret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Mikroskopiske bilder av monolags lipiddråpe. (A) Monolags lipiddråpe som inneholder fluorescerende fargestoff i emulsjonen. Bilder fra venstre til høyre viser en monolags lipiddråpe under DIC-kanalen, fluorescerende 640 nm-kanal, overlegg av henholdsvis DIC- og 640 nm-kanalen og fluorescerende 488 nm-kanalen. (B) Ulike former for innkapslet aktin inne i monolags lipiddråpen under en fluorescerende 561 nm kanal. Bilder fra venstre til høyre viser globulært aktin (G-aktin), filamentøst aktin (F-aktin), aktin som danner et tynt F-aktinlag med tilsetning av VCA-His til den endelige bufferen og nikkel-lipid til membranen, og aktin som danner et tynt F-aktinlag med tilsetning av VCA-His, cofilin og gelsolin til den endelige bufferen og nikkel-lipid til membranen. Skalastenger er 10 μm ved 63x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Mikroskopiske bilder av innkapsling av aktinnettverk inne i liposomer. (A) Et liposom innkapslende polymerisert forgrenet (Arp 2/3 nukleert) F-aktinnettverk. Fra venstre til høyre: fluorescerende 488 nm-kanal (venstre), fluorescerende 561 nm-kanal (midtstilt), overlegg (høyre). (B) Et representativt resultat av suspensjoner av liposomer som innkapsler polymeriserte forgrenede (Arp 2/3 nukleerte) F-aktinnettverk. Fra venstre mot høyre: fluoriserende kanal på 488 nm (venstre), fluoriserende kanal på 561 nm (midten) og overlegg (høyre). (C) Utseendet til dannelsen av et tynt, men tett F-aktinlag belagt langs det indre laget av lipidmembranen til et liposom. Topp til bunn: fluorescerende 488 nm kanal (øverst), fluorescerende 561 nm kanal (midten), overlegg (nederst). Skalastenger er 10 μm ved 63x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere viktige trinn bestemmer suksessen til et høyt utbytte av liposomer under forberedelsesprosessen. For å oppløse lipidfilmen helt i oljen, må prøven sonikeres til lipidfilmen i bunnen av glassflasken forsvinner helt. Etter sonikering må lipid-oljeblandingen lagres over natten ved romtemperatur under mørke forhold for at lipidmolekylene skal dispergere ytterligere29. Blandingen kan oppbevares ved 4 °C i opptil en uke. Ved fremstilling av en FB / oljeemulsjon med monolags lipiddråper som inneholder protein av interesse, må lipidolje-FB-blandingen pumpes forsiktig frem og tilbake gjennom en glasssprøyte for å unngå å introdusere luftbobler. I løpet av denne prosessen skjæres en stor dråpe av på tuppen av glasssprøyten i mange mindre dråper (~ 5-100 μm i diameter) etter flere repetisjoner. Blandingen må være hvitaktig etter prosessen30. For å kontrollere kvaliteten på fosfolipider, og om et lipidmonolag hadde blitt dannet i periferien av FB-inneholdende dråpe, ble monolags lipiddråper som inneholdt fluorescerende fargestoff undersøkt i emulsjonen, som vist i figur 2A. For å sikre passasje av monolags lipiddråper gjennom OB / oljegrensesnittet under sentrifugering, og la de oppsamlede liposomene i OB slå seg ned på glassoverflaten, bør tettheten av FB være litt høyere enn OB. Derfor ble sukrose og glukose valgt som hovedkomponent i henholdsvis indre (FB) og ytre (OB) vandige løsninger. I det forrige arbeidet ble dextran brukt til å justere tettheten av den indre vandige løsningen20, som ikke er inkludert i denne protokollen. Videre ble osmolariteten til OB justert med glukose slik at det osmotiske trykket til OB er litt større enn FB (20-60 mOsm) som rapportert i forrige arbeid20,22. Stor osmolaritetsforskjell førte til krymping (når osmolariteten til OB er større enn FB) eller brudd (når FB-osmolariteten er større enn OB) av liposomene. Et osmometer ble brukt til å kontrollere osmolaritetene til bufferne. I protokollen ble β-kasein tilsatt i OB for å passivisere både plastrørflater og glassflater i avbildningskammeret og minimere klistring mellom liposomene 20,49. Mineralolje ble brukt som oljeløsning (dvs. lipidløsningsmiddelet). Ulike lipidløsningsmidler er rapportert andre steder, inkludert dodekan 50, flytende parafin30, squalane51, etc. Følgelig brukes forskjellige sentrifugeringshastigheter og varigheter for forskjellige lipidløsningsmidler på grunn av deres viskositetsforskjeller og påvirkningen de bringer på liposomoverflatespenningen. Varigheten av trinn 2.3 må forlenges for ladede lipider fordi disse ladede molekylene i monolaget frastøter hverandre, og krever dermed mer tid til å diffundere og organisere seg godt i grensesnittet mellom lipid / oljeblandingen og OB38. For lipider innlemmet med proteiner av interesse, anbefales det også en utvidelse av dette trinnet for å sikre bedre monolagsdannelse52. For liposomutbyttet av liposomer som innkapsler polymerisert F-aktinnettverk, er antall liposomer per synsfelt (100 μm x 100 μm) rundt 5-10 med en gjennomsnittlig diameter på 20 μm. Et zoomet ut bilde av en typisk mikroskopiprøve er vist i figur 3B. Mer zoomede konfokale bilder av liposomene produsert gjennom den inverterte emulsjonsmetoden finnes i en nylig studie52 hvor forskjellige parametere (tetthetsforskjell, sentrifugeringshastighet / tid, lipidkonsentrasjon, pH, temperatur, etc.) er optimalisert for høyverdig produksjon av liposomer.

For rekonstituering av F-aktinnettverket er det viktig å velge en passende konsentrasjon av adenosintrifosfat (ATP), dithiothreitol (DTT), tilhørende salter og pH-tilstanden. Et mellomliggende kontrollpunkt i det rekonstituerte F-aktinnettverket kan gjøres ved å observere monolags lipiddråper med innkapslet aktin inni. Ulike former for innkapslet aktin inne i monolags lipiddråpen er vist i figur 2B. Aktinpolymerisasjon forekommer ved >20 mM K + salt og i >0,2 mM Mg2+ salt med pH stabilisert mellom 6,5 og 8,5, som rapportert tidligere53,54,55. Før avbildning av liposomer ble alle løsninger holdt på is for å forhindre tidlig aktinpolymerisering. Prøvene ble avbildet ved romtemperatur for å utløse aktinpolymerisasjon. Arkitekturen til det rekonstituerte F-aktinnettverket er overveiende regulert av aktiviteten til Arp2/3-komplekset. Arp 2/3-komplekset kjerner og grener aktinfilamenter fra siden av et eksisterende moderfilament for å generere dendrittiske arkitekturer56,57. Nikkellipiden (DOGS-NTA-Ni) og VCA-His er kritiske for dannelsen av F-aktinlaget. VCA-His fungerer som en kjernefremmende faktor, som er knyttet til nikkellipider ved membranen22,58. Et forgrenet F-aktinnettverk blir deretter kjernet fra VCA-His som letter Arp2/3-komplekset, og som et resultat dannes et tett F-aktinskall ved den indre brosjyren av lipidmembranen. Konsentrasjonen av VCA-His i liposomet bestemmer tykkelsen på F-aktinlaget. Tilsetningen av aktinregulerende proteiner (cofilin og gelsolin) fremmer også dannelsen av F-aktinlaget. Cofilinet kutter aktinfilamenter for å øke antall filamentender, mens gelsolinet binder seg til de piggete endene av aktinfilamentene for å begrense veksten. Dermed, i nærvær av cofilin og gelsolin, kan et større antall filamenter nukleeres av Arp2/3, og deretter rekrutteres av VCA-His for å danne F-aktinlaget.

Lignende artikler basert på emulsjonsoverføringsmetoden for proteininnkapsling har blitt publisert de siste årene 28,30,34. En stor forskjell mellom protokollen her og protokollene i disse papirene er valget av den primære lipiden for liposomer. I dette arbeidet bruker vi L-α-fosfatidylkolin (EPC, en blanding av forskjellige fosfatidylkolinarter som inneholder ca. 60% POPC59) som hovedkomponent i liposommembranen. For å danne et F-aktinlag ble en blanding av EPC og nikkel-lipid (DOGS-NTA-Ni) brukt i forholdet 10: 1. I et tidligere arbeid ble liposomer spredt på polyhistidinbelagt glass, og EPC, kolesterol og nikkel-lipid ble blandet i forholdet 53:37:1020. Til sammenligning valgte Natsume og Bashirzadeh og medarbeidere dioleoyl-fosfokolin (DOPC, en enkelt type fosfolipid) for å innkapsle henholdsvis mikrosfærer28 og fascin-aktinbunter34, mens Fujii og medarbeidere anbefalte 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC, et rent syntetisk fosfolipid) som det primære lipidet for å etablere en liposombasert membranproteinsynteseteknologi30 . Valget av de primære lipidene påvirker de fysiske egenskapene til liposomer. For eksempel, når graden av umettethet av acylkjeden øker (dvs. POPC< EPC< DOPC60), reduseres permeabilitetsegenskapene til forskjellige molekyler gjennom dobbeltlaget61. Valget avhenger også av at lipidene av interesse blandes. For eksempel gjør tilsetningen av kolesterolet EPC liposomer mer stabile, mens det destabiliserer dobbeltlagsstrukturen til DOPC / DOPE-blandingen61.

Likhetene mellom dette arbeidet og en nylig publikasjon fra Bashirzadeh et al.34 faller på samme tema aktin innkapsling. Samtidig er det klare skillelinjer. Bashirzadeh og medarbeidere rapporterte en modifisert cDICE-tilnærming ved hjelp av et 3D-printet roterende kammer. Her vedtar vi den enkle, tradisjonelle inverterte emulsjonsoverføringsmetoden ved hjelp av en sprøyte og en sentrifugemaskin. Begge disse to metodene genererer et høyt utbytte av liposomer og har høy innkapslingseffektivitet for store biomolekyler24. I tillegg til forskjellen i lipidkomponentene som nevnt ovenfor, endres arkitekturene til det innkapslede aktinnettverket også. Bashirzadeh og medarbeidere innkapslet fascin-aktinbunter i liposomet, mens vi i dette arbeidet innkapslet et forgrenet nettverk utløst av Arp2/3-komplekset. I tillegg har dannelsen av et F-aktinlag for å skape et cortex-biomimicking-system i nærvær VCA-His blitt utarbeidet her.

Metoden som er rapportert her har to begrensninger. Den ene er at størrelsen på liposomene som inkorporerer in vitro rekonstituerte aktinnettverk ikke kan manipuleres nøyaktig (varierende fra 5 til 50 μm i diameter), og utbyttet er lavt sammenlignet med elektroformasjonsmetoden. Den andre begrensningen av en vannoljebasert metode er at spormengder av olje er fanget mellom tolagsbrosjyrene24. Selv om det ikke signifikant påvirker membrantykkelsen eller biokompatibiliteten til disse bio-etterlignende liposomene 24,35,62,63, kan membrandynamikken til de oljeinnsatte liposomene endres 62. I denne metoden er aktinkjernen Arp2/3 inkorporert. Fremtidige studier kan omfatte andre cytoskelettproteiner 64,65,66,67, nukleatorer, som formin68, eller molekylære motorer som myosin II 69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi anerkjenner finansiering ARO MURI W911NF-14-1-0403 til MPM, National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 til MPM, National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 og Human Frontiers Science Program (HFSP) tilskuddsnummer RGY0073/2018 til MPM Enhver mening, funn, konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er de av forfatterne (e) og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til ARO, NIH eller HFSP. SC anerkjenner fruktbare diskusjoner med V. Yadav, C. Muresan og S. Amiri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

Tags

Bioteknologi utgave 186
<em>In vitro</em> Rekonstituering av aktincytoskjelettet inne i gigantiske unilamellære vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. … More

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter