שיטה חצי אוטומטית וניתנת לשחזור ביולוגית לכימות תצהיר סידן במבחנה
Summary
מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם. הסתיידות כלי הדם תורמת באופן משמעותי לנטל התחלואה והתמותה. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לכימות משקעי סידן בתיווך תאי שריר חלקים במבחנה על ידי הדמיה פלואורסצנטית.
Abstract
הסתיידות כלי הדם כוללת סדרה של פתולוגיות ניווניות, כולל דלקת, שינויים בפנוטיפ התאים, מוות של תאים והיעדר מעכבי הסתיידות, שמובילים במקביל לאובדן גמישות ותפקוד כלי הדם. הסתיידות כלי הדם תורמת תרומה חשובה לתחלואה ולתמותה בפאתולוגיות רבות, כולל מחלת כליות כרונית, סוכרת וטרשת עורקים. מודלי המחקר הנוכחיים לחקר הסתיידות כלי הדם מוגבלים וניתנים ליישום רק בשלבים מאוחרים של התפתחות ההסתיידות in vivo. כלים במבחנה לחקר הסתיידות כלי דם משתמשים במדידות נקודת קצה, מגדילים את הדרישות מחומר ביולוגי ומסתכנים בהכנסת שונות למחקרים. אנו מדגימים את היישום של בדיקה חדשנית המסומנת באופן פלואורסצנטי הנקשרת להתפתחות הסתיידות במבחנה על תאי שריר חלק של כלי דם אנושיים וקובעת את ההתפתחות בזמן אמת של הסתיידות חוץ גופית . בפרוטוקול זה אנו מתארים את היישום של בדיקת ההסתיידות החדשה שפיתחנו, כלי חדשני במידול מחלות שיש לו יישומים תרגומיים פוטנציאליים. אנו צופים כי בדיקה זו תהיה רלוונטית במגוון רחב יותר של מחקרי תצהיר מינרלים, כולל יישומים במחקר עצמות, סחוס או שיניים.
Introduction
הסתיידות כלי דם (VC) היא גורם סיכון עצמאי לתחלואה קרדיווסקולרית ותמותה 1,2,3. הוא נחשב זה מכבר לתהליך כימי פסיבי של תצהיר מינרלים חוץ רחמיים, וכעת הוא נראה כתגובת ריפוי רקמות הניתנת לשינוי הכוללת תרומה אקטיבית של תאים שונים, כולל תאי שריר חלק של כלי הדם המופעלים (hVSMC) כגורם למחלה 4,5. In vivo ניתן למדוד VC על ידי סריקות CT מרובות פרוסות כהערכה של עומס טרשת עורקים 6,7,8. כיום, מתרחש שינוי פרדיגמה, שבו חומרת VC הופכת להיות מוכרת כגורם סיכון למחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג II, מחלת כליות כרונית והזדקנות 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMCs הם סוג התא הנפוץ ביותר במערכת הלב וכלי הדם ושחקן מרכזי בפיתוח VC. הסתיידות המושרה על-ידי hVMC במבחנה היא מודל מחלות נפוץ לחקר מחלות לב וכלי דם16,17. עם זאת, רוב הפרוטוקולים לזיהוי הסתיידות חוץ גופית משתמשים במדידות נקודת קצה שיכולות להגביל את רכישת הנתונים, דורשות שימוש רב יותר בחומר תאי ויכולות להאט את המחקר. שיטות נפוצות לזיהוי הסתיידות hVSMC במבחנה כוללות את בדיקת o-cresolphthalein, המודדת תצהיר סידן מסיס כנגד סך החלבון ודורשת תזה18. כמו כן, מכתים אדומים Alizarin משמש, אשר נקשר ישירות משקעי סידן על תאים קבועים או רקמות19. כדי לחקור הסתיידות hVSMC לאורך זמן עם o-cresolphthalein או Alizarin אדום דורש קבוצות של שכפולים לכל נקודת זמן, להגדיל את הביקוש על חומר ביולוגי, בתורו, להגדיל את הסיכוי של השתנות.
במאמר זה אנו מפרטים את השיטה ליישום בדיקה חדשנית המשתמשת ב- hVSMCs עם בדיקת הדמיה פלואורסצנטית כדי לקבוע התקדמות VC במבחנה , כמו גם לתפקד כבדיקת הסתיידות חד-שלבית סופית. הוכחנו בעבר כי בדיקה זו דומה באופן ישיר לשיטות o-cresolphthalein ו- Alizarin Red וניתן להשתמש בה כדי להבחין בין תנאי תרבית משתנים20. בנוסף למדידות בזמן אמת, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לקבוע את הנטייה של דגימות סרום או פלזמה כסמן פונדקאי לפיתוח VC קליני20. זה יסייע ביישום אסטרטגיות ביולוגיות של מדעי הלב וכלי הדם ומידול מחלות. יישום נוסף של הבדיקה עשוי להיות כמערכת BioHybrid תרגומית להערכת חומרת VC או התקדמות ממרכיבי דם כגון סרום או פלזמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה אנו מתארים שיטה חצי אוטומטית לקביעת הסתיידות במבחנה . עבור שיטה זו, יש לייעל שלושה שלבים קריטיים של הסתיידות hVSMC. ראשית, צפיפות התאים היא קריטית להתפתחות הסתיידות hVSMC. צפיפות נמוכה של hVSMCs תגרום להסתיידות איטית או ללא הסתיידות ולמוות של תאים עקב היעדר מגע בין תא לתא והלחץ המוש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי תוכניות המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי סקלודובסקה-קירי No 722609 and 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). מחקר זה נתמך על ידי BioSPX. WJ-D קיבל מימון מ-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) TRR219-מזהה פרויקט 322900939 ומזהה פרויקט 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O’Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
