Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca2+ em miócitos de roedores
Summary
Um conjunto de protocolos são apresentados que descrevem a medida da função contrátil via detecção do comprimento do sarcômero juntamente com a medição transitória de cálcio (Ca2+) em miócitos isolados de ratos. A aplicação desta abordagem para estudos em modelos animais de insuficiência cardíaca também está incluída.
Abstract
A disfunção contrátil e os transientes de Ca2+ são frequentemente analisados a nível celular como parte de uma avaliação abrangente da lesão e/ou remodelação induzida pelo coração. Uma abordagem para avaliar essas alterações funcionais utiliza o encurtamento descarregado e análises transitórias de Ca2+ em miócitos cardíacos adultos primários. Para esta abordagem, os miócitos adultos são isolados por digestão de colagenase, tornados tolerantes ao Ca2+ e, em seguida, aderidos a coberturas revestidas de laminina, seguidas de estimulação elétrica em meio livre de soro. O protocolo geral utiliza miócitos cardíacos de ratos adultos, mas pode ser prontamente ajustado para miócitos primários de outras espécies. Alterações funcionais em miócitos de corações lesados podem ser comparadas a miócitos simulados e/ou a tratamentos terapêuticos in vitro . A metodologia inclui os elementos essenciais necessários para a estimulação dos miócitos, juntamente com a câmara celular e os componentes da plataforma. O protocolo detalhado para esta abordagem incorpora as etapas para medir o encurtamento descarregado pela detecção do comprimento do sarcômero e transientes celulares de Ca2+ medidos com o indicador ratiometric Fura-2 AM, bem como para a análise de dados brutos.
Introduction
A análise da função da bomba cardíaca geralmente requer uma série de abordagens para obter uma visão adequada, especialmente para modelos animais de insuficiência cardíaca (IC). A ecocardiografia ou as medidas hemodinâmicas fornecem informações sobre a disfunção cardíaca in vivo 1, enquanto abordagens in vitro são frequentemente empregadas para identificar se a disfunção surge de alterações no miofilamento e/ou no transiente Ca2+ responsável pela excitação do acoplamento, ou o potencial de ação, com função contrátil (por exemplo, acoplamento excitação-contração [E-C]). As abordagens in vitro também oferecem uma oportunidade para rastrear a resposta funcional a neurohormônios, alterações genéticas induzidas por vetores, bem como potenciais agentes terapêuticos2 antes de buscar estratégias de tratamento in vivo dispendiosas e/ou trabalhosas.
Várias abordagens estão disponíveis para investigar a função contrátil in vitro, incluindo medidas de força em trabéculas3 intactas ou miócitos permeabilizados4, bem como encurtamento descarregado e transientes de Ca2+ em miócitos intactos na presença e ausência de IC 5,6. Cada uma dessas abordagens tem como foco a função contrátil dos miócitos cardíacos, que é diretamente responsável pela função da bomba cardíaca 2,7. No entanto, a análise da contração e do acoplamento E-C é mais frequentemente realizada medindo o encurtamento do comprimento muscular e os transientes de Ca 2+ em miócitos adultos isolados e tolerantes a Ca2+. O laboratório utiliza um protocolo detalhado publicado para isolar miócitos de corações de ratos para esta etapa8.
Tanto o transiente de Ca2+ quanto os miofilamentos contribuem para o encurtamento e realongamento dos miócitos intactos e podem contribuir para a disfunção contrátil 2,7. Assim, esta abordagem é recomendada quando a análise funcional in vitro requer um miócito intacto contendo a maquinaria de ciclagem Ca2+ mais os miofilamentos. Por exemplo, miócitos isolados intactos são desejáveis para o estudo da função contrátil após a modificação do miofilamento ou da função de ciclagem de Ca2+ via transferência gênica9. Além disso, uma abordagem de miócitos intactos é sugerida para analisar o impacto funcional dos neurohormônios ao estudar o impacto das vias de sinalização do segundo mensageiro a jusante e/ou a resposta a agentes terapêuticos2. Uma medida alternativa da força dependente da carga em miócitos únicos é mais frequentemente realizada após a permeabilização da membrana (ou esfolamento) a baixas temperaturas (≤15 °C) para remover a contribuição transitória de Ca2+ e focar na função miofilamentar10. A medida da força dependente da carga mais transientes de Ca2+ em miócitos intactos é rara devido em grande parte ao desafio complexo e técnico da abordagem11, especialmente quando é necessário maior rendimento, como para medir as respostas à sinalização neurohormonal ou como uma tela para agentes terapêuticos. A análise das trabéculas cardíacas supera esses desafios técnicos, mas também pode ser influenciada por não miócitos, fibrose e/ou remodelamento da matriz extracelular2. Cada uma das abordagens descritas acima requer uma preparação contendo miócitos adultos porque os miócitos neonatais e miócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzíveis (iPSCs) ainda não expressam o complemento completo de proteínas de miofilamento adulto e geralmente não possuem o nível de organização de miofilamentos presente no miócito adulto em forma de bastonete2. Até o momento, evidências em iPSCs indicam que a transição completa para isoformas adultas excede mais de 134 dias em cultura12.
Dado o foco desta coleção na IC, os protocolos incluem abordagens e análises para diferenciar a função contrátil em miócitos intactos com falha versus não falha. Exemplos representativos são fornecidos a partir de miócitos de ratos estudados 18-20 semanas após uma coarctação suprarrenal, descrita anteriormente 5,13. Comparações são então feitas com miócitos de ratos tratados com simulação.
O protocolo e a plataforma de imagem aqui descritos são utilizados para analisar e monitorar alterações no encurtamento e transientes de Ca2+ em miócitos cardíacos em forma de bastonete durante o desenvolvimento de IC. Para esta análise, miócitos em forma de bastonete tolerantes a 2 x 10 44 Ca2+ são banhados em coberturas de vidro revestidas de laminina (CSs)de 22 mm 2 mm e cultivados durante a noite, conforme descrito anteriormente8. Os componentes montados para esta plataforma de imagem, juntamente com os meios e buffers usados para imagens ideais, são fornecidos na Tabela de Materiais. Um guia para análise de dados usando um software e os resultados representativos também são fornecidos aqui. O protocolo geral é dividido em subseções separadas, com as três primeiras seções se concentrando em miócitos isolados de ratos e análise de dados, seguidas por experimentos transitórios celulares de Ca2+ e análise de dados em miócitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo de estimulação crônica descrito na etapa 1 estende o tempo útil para estudar miócitos isolados e avaliar o impacto de tratamentos mais longos. Em nosso laboratório, resultados consistentes foram obtidos até 4 dias após o isolamento ao medir a função contrátil usando o comprimento do sarcômero em miócitos cronicamente cadenciados. No entanto, a função contrátil dos miócitos se deteriora rapidamente ao usar meios com mais de 1 semana para acelerar os miócitos.
Para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) grant R01 HL144777 (MVW).
Materials
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps – Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: — Photon counting system – Xenon power supply with dual excitation light source – Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. – The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps – Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing – E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90 | Panel A #11 |
References
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