변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정
Summary
광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.
Abstract
살아있는 배아, 애벌레 또는 어린 제브라 피쉬의 몸 전체에 걸쳐 개별 세포를 시각화하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 형광으로 표시된 원형질막이 있는 활어를 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 스캔하여 근육 조직의 부피와 존재하는 근육 섬유의 수를 결정할 수 있음을 보여줍니다. 시간 경과에 따른 살아있는 동물의 세포 수와 크기를 측정하기 위한 효율적인 접근 방식이 설명되고 보다 힘든 분할 방법에 대해 검증됩니다. 근육의 전기 및 수축 활동을 제어 할 수있는 방법이 설명되어 있습니다. 골격근 수축 활동의 손실은 근육 성장을 크게 감소시켰다. 유충에서는 패턴화 된 전기 유발 수축 활동의 재 도입을 허용하는 프로토콜이 설명됩니다. 설명 된 방법은 개인 간 변동성의 영향을 최소화하고 살아있는 유기체의 맥락에서 다양한 세포 및 생리적 성장 매개 변수에 대한 전기적, 유전 적, 약물 적 또는 환경 적 자극의 효과를 분석 할 수 있습니다. 개인에 대한 정의된 조기 개입의 측정된 효과에 대한 장기 추적 관찰을 이후에 수행할 수 있습니다.
Introduction
세포 수 (증식) 및 / 또는 세포 크기 (비대)의 증가를 포함하는 조절 된 조직 성장은 발달, 재생, 생태 학적 및 진화 적 적응에 중요한 요소입니다. 최근 수십 년 동안 세포 및 발달 생물학에 대한 분자 유전 학적 이해가 크게 발전했음에도 불구하고 조직 및 장기 크기 조절에 대한 기계 론적 이해는 아직 초기 단계에 있습니다. 이러한 지식의 부족에 대한 한 가지 이유는 필요한 공간적, 시간적 정확성으로 살아있는 유기체의 조직 성장을 정량화하기가 어렵 기 때문입니다.
전체 유기체의 성장의 다양한 측면을 시간이 지남에 따라 반복적으로 측정하여 각 개별 1,2,3,4,5에 대한 성장 곡선을 나타낼 수 있습니다. 이중 X선 흡수측정법(DXA), 컴퓨터 단층 촬영(CT) 및 자기공명영상(MRI)과 같이 점점 더 정교해지는 스캐닝 방법을 통해 인간 및 모델 유기체 모두에서 단일 개체에서 전체 장기 및 기타 신체 영역(예: 개별적으로 식별된 골격근)의 성장을 추적할 수 있습니다.6,7,8,9,10 . 그러나 이러한 방법은 아직 개별 세포를 밝힐 수 있는 해상도가 없으므로 세포 행동과 조직 수준 성장 사이의 연관성을 식별하기 어려웠습니다. 이러한 연관성을 만들기 위해 전통적인 연구는 종종 유사한 개별 동물의 코호트에 의존했으며, 그 중 일부는 연속적인 시점에서 희생 된 다음 세포 학적 세부 사항으로 분석됩니다. 이러한 접근법은 (바람직하게는 유사하지만 그럼에도 불구하고 가변적 인) 개인의 그룹에 걸쳐 관찰 된 변화를 평균화해야하므로 시간적 및 공간적 해상도가 부족하여 원인과 결과를 암시하는 세포 수준에서 상관 된 사건을 찾기가 어렵습니다.
무척추 동물 모델 유기체에 대한 연구는 처음에 C. elegans와 D. melanogaster에서 세포 분해능을 달성하고 단일 개체의 시간 경과에 따른 성장을 정확하게 측정하기 위해 광학 현미경을 개발하여 이러한 문제를 우회했습니다. 이러한 연구는 이러한 작은 모델 유기체 11,12,13,14,15,16,17의 성장에서 현저하게 불변하는 세포 계통 행동을 밝혀 냈습니다. 그러나 모든 척추 동물을 포함한 많은 동물은 불확실한 세포 계통을 가지고 있으며 유 전적으로 암호화 된 성장 프로그램을 모든 구성 조직과 기관의 크기가 적절하게 일치하는 기능적 3 차원 유기체로 바꾸는 신비한 피드백 과정에 의해 조직 성장을 제어합니다. 이러한 복잡한 성장 과정을 이해하려면 선택한 시간에 유전적, 약리학적 또는 기타 개입에 의해 실험적으로 조작할 수 있고 이후에 효과를 분석할 수 있는 단일 개체에서 시간이 지남에 따라 전체 조직 또는 기관을 이미지화하는 것이 바람직합니다.
각 척추 동물 골격근은 정의 된 크기, 모양 및 기능을 가지고 있으며 뼈, 힘줄 및 신경과 같은 인접한 조직과의 잘 특성화 된 상호 작용을 가지고 있습니다. 일부 근육은 작고 피부 바로 아래에 있으므로 고해상도 이미징 연구에 적합합니다. 대부분의 장기와 마찬가지로 각 근육은 안정적인 성인 크기에 도달하기 전에 배아, 출생 후 및 청소년 생활 전반에 걸쳐 성장합니다. 그러나 근육은 또한 사용과 영양에 따라 성인 생활 동안 크기를 변화시키는 독특한 능력을 가지고 있습니다.18, 이 특성은 유기체 건강, 스포츠 성능 및 독립 생활에 큰 영향을 미칩니다. 노년기의 근육량과 기능 상실, 근육 감소증은 고령화 인구 19,20,21에 직면 한 사회에 대한 관심이 증가하는 문제입니다.
우리와 다른 사람들은 조직 성장, 유지 및 복구를 관찰하고 조작 할 수있는 수백 개의 세포를 포함하는 분명히 닫힌 시스템으로서 제브라 피쉬 유충의 분절 반복 몸체에서 골격근 조직의 정의 된 블록의 성장에 초점을 맞추 었습니다 22,23,24,25,26. 일부 정량적 작업은 이전에 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35로보고되었지만 시간이 지남에 따라 개별 척추 동물의 세포 세부 사항에서 근육 성장을 측정하는 상세하고 검증 된 방법은 없습니다. 여기에는 검증과 함께 이러한 반복 측정을 수행하는 방법에 대한 효율적인 프로토콜이 설명되며, 변경된 전기 활동에 대한 반응으로 비대 및 과형성 성장의 변화를 분석하는 데 사용되는 예가 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 색소 침착이 영상에 큰 방해가되지 않고 일시적인 마취 및 / 또는 고정이 잘 견딜 수있는 단계 또는 유전 적 변이에서 살아있는 제브라 피쉬 유충의 근육량을 정확하고 효율적으로 추정하는 방법을보고합니다. 우리는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용했지만 설명된 접근 방식은 스피닝 디스크 컨포칼 또는 라이트 시트 현미경 및 별개의 초점면에서 이미지 스택을 생성하는 다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Hughes 연구소 구성원인 Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin 및 Vladimir Snetkov가 설명된 프로토콜의 개발을 위해 기울인 노력과 플라스미드 또는 제브라피쉬 라인을 공유한 Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau 및 Peter Currie에게 깊은 빚을 지고 있습니다. SMH는 프로그램 보조금 G1001029, MR / N021231 / 1 및 MR / W001381 / 1 지원을받는 의학 연구위원회 (MRC) 과학자입니다. MA는 King ‘s College London에서 MRC 박사 과정 과정 박사 과정 학생을 취득했습니다. 이 작업은 학자, 멘토 및 친구인 David M. Robinson의 삼각법 입력의 혜택을 받았습니다.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
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