Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü
Summary
Optik berraklık, zebra balıklarında hücre biyolojik ve fizyolojik çalışmaları için önemli bir avantajdır. Bireysel hayvanlarda hücre büyümesinin ölçülmesi için sağlam yöntemler, iskelet kasının ve komşu dokuların büyümesinin tüm vücut büyümesiyle nasıl bütünleştiğine dair yeni bilgiler sağlayan tanımlanmıştır.
Abstract
Canlı embriyonik, larva veya yavru zebra balıklarının vücudundaki bireysel hücreleri görselleştirmek için bir dizi yöntem kullanılabilir. Floresan işaretli plazma zarlarına sahip canlı balıkların, kas dokusunun hacmini ve mevcut kas liflerinin sayısını belirlemek için konfokal lazer tarama mikroskobunda taranabileceğini gösteriyoruz. Canlı hayvanlarda zaman içinde hücre sayısı ve büyüklüğünün ölçülmesi için etkili yaklaşımlar tanımlanmış ve daha zorlu segmentasyon yöntemlerine karşı doğrulanmıştır. Kas elektriksel ve dolayısıyla kasılma aktivitesinin kontrolüne izin veren yöntemler açıklanmaktadır. İskelet kası kasılma aktivitesinin kaybı, kas büyümesini büyük ölçüde azaltmıştır. Larvalarda, desenli elektriksel uyarılmış kontraktil aktivitenin yeniden sokulmasına izin veren bir protokol açıklanmaktadır. Açıklanan yöntemler, bireyler arası değişkenliğin etkisini en aza indirir ve elektriksel, genetik, ilaç veya çevresel uyaranların canlı organizma bağlamında çeşitli hücresel ve fizyolojik büyüme parametreleri üzerindeki etkisinin analizine izin verecektir. Tanımlanmış bir erken yaşam müdahalesinin bireyler üzerindeki ölçülen etkilerinin uzun süreli takibi daha sonra yapılabilir.
Introduction
Hücre sayısındaki (hiperplazi) ve / veya hücre boyutundaki (hipertrofi) artışı içeren düzenlenmiş doku büyümesi, gelişim, rejenerasyon ve ekolojik ve evrimsel adaptasyonda çok önemli bir faktördür. Son yıllarda hem hücre hem de gelişim biyolojisinin moleküler genetik anlayışındaki büyük ilerlemelere rağmen, doku ve organ büyüklüğünün düzenlenmesine ilişkin mekanik anlayış hala emekleme aşamasındadır. Bilgideki bu lakunanın bir nedeni, canlı organizmalardaki doku büyümesini gerekli mekansal ve zamansal doğrulukla ölçmenin zorluğudur.
Tüm organizmaların büyümesinin çeşitli yönleri zaman içinde tekrar tekrar ölçülebilir ve her birbirey için büyüme eğrileri ortaya çıkar 1,2,3,4,5. Çift X-ışını absorpsiyometrisi (DXA), bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi giderek daha sofistike hale gelen tarama yöntemleri, hem insan hem de model organizmalarda tek bireylerde tüm organların ve diğer vücut bölgelerinin (örneğin, bireysel olarak tanımlanmış iskelet kasları) büyümesinin izlenmesine izin verir 6,7,8,9,10 . Bununla birlikte, bu yöntemler henüz bireysel hücreleri ortaya çıkarma çözünürlüğüne sahip değildir ve bu nedenle hücresel davranışlar ile doku seviyesi büyümesi arasındaki bağlantıları ayırt etmek zor olmuştur. Bu tür bağlantılar kurmak için, geleneksel çalışmalar genellikle benzer bireysel hayvanların kohortlarına güvenmiştir; bunlardan birkaçı ardışık zaman noktalarında kurban edilir ve daha sonra sitolojik ayrıntılarla analiz edilir. Bu tür yaklaşımlar, (tercihen benzer, ancak yine de değişken) birey grupları arasında gözlemlenen değişikliklerin ortalamasını almayı gerektirir ve bu nedenle zamansal ve mekansal çözünürlük eksikliğinden muzdariptir, bu da hücresel düzeyde neden-sonuç düşündüren korelasyonlu olayları bulmayı zorlaştırır.
Başlangıçta C. elegans ve D. melanogaster’de omurgasız model organizmalar üzerine yapılan çalışmalar, hücresel çözünürlük elde etmek ve tek bireylerde zaman içindeki büyümeyi doğru bir şekilde ölçmek için optik mikroskopi geliştirerek bu sorunları aşmıştır. Bu tür çalışmalar, bu küçük model organizmaların büyümesinde çarpıcı bir şekilde değişmez hücre soy davranışlarını ortaya koymuştur 11,12,13,14,15,16,17. Bununla birlikte, tüm omurgalılar da dahil olmak üzere birçok hayvan, belirsiz hücre soylarına sahiptir ve genetik olarak kodlanmış büyüme programını, tüm kurucu dokuları ve organları uygun şekilde eşleşen işlevsel üç boyutlu bir organizmaya dönüştürmeye yarayan gizemli geri bildirim süreçleriyle doku büyümesini kontrol eder. Bu karmaşık büyüme süreçlerini anlamak için, seçim zamanında genetik, farmakolojik veya diğer müdahalelerle deneysel olarak manipüle edilebilen ve daha sonra analiz edilen etki olan tek bireylerde zaman içinde tüm dokuların veya organların görüntülenmesi arzu edilir.
Her omurgalı iskelet kası tanımlanmış bir boyuta, şekle ve işleve kemik, tendon ve sinirler gibi bitişik dokularla iyi karakterize edilmiş etkileşimlere sahiptir. Bazı kaslar küçüktür, cildin hemen altında bulunur ve bu nedenle yüksek çözünürlüklü görüntüleme çalışmaları için iyi adaylardır. Çoğu organa benzer şekilde, her kas stabil bir yetişkin boyutuna ulaşmadan önce embriyonik, doğum sonrası ve genç yaşam boyunca büyür. Bununla birlikte, kas, yetişkin yaşamı boyunca, kullanıma ve beslenmeye bağlı olarak boyut değiştirme konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir18 ve bu özelliğin organizma zindeliği, spor performansı ve bağımsız yaşam üzerinde büyük bir etkisi vardır. Yaşlılıkta kas kütlesi ve fonksiyon kaybı, sarkopeni, yaşlanan bir nüfusla karşı karşıya kalan toplumlar için artan bir endişe konusudur 19,20,21.
Biz ve diğerleri, zebra balığı larvalarının segmental olarak tekrarlayan gövdesinde, doku büyümesinin, bakımının ve onarımının gözlemlenebileceği ve manipüle edilebileceği birkaç yüz hücre içeren görünüşte kapalı bir sistem olarak tanımlanmış iskelet kas dokusu bloklarının büyümesine odaklandık22,23,24,25,26. Bazı nicel çalışmalar daha önce 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 olarak bildirilmiş olsa da, zaman içinde bireysel omurgalı organizmalarda hücresel detaylarda kas büyümesini ölçmek için ayrıntılı ve doğrulanmış bir yöntem mevcut değildir. Burada, bu tür tekrarlanan ölçümlerin nasıl yapılacağına dair etkili bir protokol, doğrulama ile birlikte tanımlanmıştır ve değiştirilmiş elektriksel aktiviteye yanıt olarak hem hipertrofik hem de hiperplastik büyümedeki değişiklikleri analiz etmek için kullanımının bir örneği verilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, pigmentasyonun görüntülemeye büyük bir engel teşkil etmediği ve geçici anestezi ve/veya immobilizasyonun iyi tolere edildiği aşamalarda veya genetik varyantlarda canlı zebra balığı larvalarının kas hacminin doğru ve etkili bir şekilde tahmin edilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Lazer taramalı konfokal mikroskopiyi kullanmış olsak da, açıklanan yaklaşımlar dönen disk konfokal veya ışık tabakası mikroskobu ve farklı odak düzlemlerinde görüntü yığınları oluşturan diğer yönt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Hughes laboratuvar üyeleri Dr. Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin ve Vladimir Snetkov’un açıklanan protokollerin geliştirilmesi için ve Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau ve Peter Currie’nin plazmidleri veya zebra balığı çizgilerini paylaşma çabalarına derinden borçludur. SMH, Program Hibe G1001029, MR / N021231 / 1 ve MR / W001381 / 1 desteğine sahip bir Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) Bilim Adamıdır. Yüksek Lisans, King’s College London’dan MRC Doktora Eğitim Programı Doktora Öğrencisi olarak görev yaptı. Bu çalışma, akademisyen, akıl hocası ve arkadaşı David M. Robinson’un trigonometrik girdilerinden yararlandı.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish – Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book – A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
