Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada
Summary
A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.
Abstract
Vários métodos podem ser usados para visualizar células individuais em todo o corpo de peixes-zebra embrionários, larvais ou juvenis vivos. Mostramos que peixes vivos com membranas plasmáticas marcadas fluorescentemente podem ser escaneados em um microscópio confocal de varredura a laser, a fim de determinar o volume de tecido muscular e o número de fibras musculares presentes. Abordagens eficientes para a medição do número e tamanho celular em animais vivos ao longo do tempo são descritas e validadas contra métodos de segmentação mais árduos. São descritos métodos que permitem o controle da atividade elétrica muscular e, portanto, contrátil. A perda de atividade contrátil do músculo esquelético reduziu muito o crescimento muscular. Em larvas, é descrito um protocolo que permite a reintrodução da atividade contrátil evocada elétrica padronizada. Os métodos descritos minimizam o efeito da variabilidade interindividual e permitirão a análise do efeito de estímulos elétricos, genéticos, medicamentosos ou ambientais em uma variedade de parâmetros de crescimento celular e fisiológico no contexto do organismo vivo. O acompanhamento a longo prazo dos efeitos medidos de uma intervenção definida no início da vida em indivíduos pode ser subsequentemente realizado.
Introduction
O crescimento regulado do tecido, compreendendo o aumento do número de células (hiperplasia) e/ou do tamanho celular (hipertrofia), é um fator crucial no desenvolvimento, regeneração e adaptação ecológica e evolutiva. Apesar dos enormes avanços na compreensão genética molecular da biologia celular e do desenvolvimento nas últimas décadas, a compreensão mecanicista da regulação do tamanho dos tecidos e órgãos ainda está em sua infância. Uma das razões para essa lacuna no conhecimento é a dificuldade de quantificar o crescimento tecidual em organismos vivos com a necessária precisão espacial e temporal.
Vários aspectos do crescimento de organismos inteiros podem ser medidos repetidamente ao longo do tempo, revelando curvas de crescimento para cada indivíduo 1,2,3,4,5. Métodos de varredura cada vez mais sofisticados, como a absorciometria dupla de raios X (DXA), a tomografia computadorizada (TC) e a ressonância magnética (RM), permitem o rastreamento do crescimento de órgãos inteiros e outras regiões do corpo (por exemplo, músculos esqueléticos identificados individualmente) em indivíduos isolados, humanos e em organismos modelo 6,7,8,9,10 . No entanto, esses métodos ainda não têm a resolução de revelar células individuais e, portanto, as ligações entre os comportamentos celulares e o crescimento do nível tecidual têm sido difíceis de discernir. Para fazer tais ligações, os estudos tradicionais muitas vezes se basearam em coortes de animais individuais semelhantes, alguns dos quais são sacrificados em pontos de tempo sucessivos e, em seguida, analisados em detalhes citológicos. Tais abordagens requerem a média das mudanças observadas entre grupos de indivíduos (de preferência semelhantes, mas ainda assim variáveis) e, portanto, sofrem de uma falta de resolução temporal e espacial, tornando difícil encontrar eventos correlacionados no nível celular sugestivos de causa e efeito.
Estudos em organismos modelo de invertebrados, inicialmente em C. elegans e D. melanogaster, contornaram esses problemas desenvolvendo microscopia óptica para alcançar a resolução celular e medir com precisão o crescimento ao longo do tempo em indivíduos individuais. Tais estudos têm revelado comportamentos de linhagem celular surpreendentemente invariantes no crescimento desses pequenos organismos-modelo 11,12,13,14,15,16,17. No entanto, muitos animais, incluindo todos os vertebrados, têm linhagens celulares indeterminadas e controlam o crescimento de tecidos por meio de misteriosos processos de feedback que servem para transformar o programa de crescimento geneticamente codificado em um organismo tridimensional funcional com todos os seus tecidos e órgãos constituintes adequadamente combinados em tamanho. Para entender esses processos complexos de crescimento, é desejável visualizar tecidos ou órgãos inteiros ao longo do tempo em indivíduos individuais que possam ser manipulados experimentalmente por intervenções genéticas, farmacológicas ou outras em um momento de escolha e o efeito posteriormente analisado.
Cada músculo esquelético vertebrado tem um tamanho, forma e função definidos, e interações bem caracterizadas com tecidos adjacentes, como osso, tendão e nervos. Alguns músculos são pequenos, ficam logo abaixo da pele e, portanto, são bons candidatos para estudos de imagem de alta resolução. Semelhante à maioria dos órgãos, cada músculo cresce ao longo da vida embrionária, pós-natal e juvenil, antes de atingir um tamanho adulto estável. O músculo, no entanto, também tem uma capacidade única de mudar de tamanho durante a vida adulta, dependendo do uso e da nutrição18, e essa propriedade tem um grande impacto na aptidão do organismo, no desempenho esportivo e na vida independente. A perda de massa muscular e função na velhice, a sarcopenia, é uma questão de crescente preocupação para as sociedades frente ao envelhecimento da população 19,20,21.
Nós e outros temos focado no crescimento de blocos definidos de tecido muscular esquelético no corpo segmentarmente repetitivo de larvas de peixe-zebra, como um sistema aparentemente fechado contendo várias centenas de células nas quais o crescimento, manutenção e reparo tecidual podem ser observados e manipulados 22,23,24,25,26. Embora alguns trabalhos quantitativos tenham sido relatados anteriormente 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, nenhum método detalhado e validado de medir o crescimento muscular em detalhes celulares em organismos vertebrados individuais ao longo do tempo está disponível. Aqui um protocolo eficiente de como realizar tais medições repetidas é descrito, juntamente com a validação, e um exemplo de seu uso para analisar mudanças no crescimento hipertrófico e hiperplásico em resposta à atividade elétrica alterada é fornecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui relatamos um método para estimativa precisa e eficiente do volume muscular de larvas vivas de peixe-zebra em estágios ou em variantes genéticas em que a pigmentação não é um grande obstáculo à imagem e quando a anestesia transitória e/ou imobilização é bem tolerada. Considerando que empregamos a microscopia confocal de varredura a laser, as abordagens descritas são aplicáveis à microscopia confocal ou de folha de luz de disco giratório e a qualquer outro método que crie pilhas de imagens em planos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores estão profundamente em dívida com os esforços dos membros do laboratório Hughes, Drs. Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin e Vladimir Snetkov, para o desenvolvimento dos protocolos descritos, e para Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau e Peter Currie para compartilhar plasmídeos ou linhas de peixe-zebra. A SMH é uma cientista do Conselho de Pesquisa Médica (MRC) com a Bolsa do Programa G1001029, MR/N021231/1 e MR/W001381/1 de apoio. MA realizou um MRC Doctoral Training Program PhD Studentship do King’s College London. Este trabalho se beneficiou da contribuição trigonométrica de David M. Robinson, estudioso, mentor e amigo.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
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