sanntid og gjentatt måling av skjelettmuskelvekst hos individuelle levende sebrafisk utsatt for endret elektrisk aktivitet
Summary
Optisk klarhet er en stor fordel for cellebiologisk og fysiologisk arbeid hos sebrafisk. Det beskrives robuste metoder for måling av cellevekst hos enkeltdyr som gir ny innsikt i hvordan vekst av skjelettmuskulatur og nabovev integreres med helkroppsvekst.
Abstract
En rekke metoder kan brukes til å visualisere individuelle celler i hele kroppen av levende embryonale, larve eller unge sebrafisk. Vi viser at levende fisk med fluorescerende merkede plasmamembraner kan skannes i et konfokalt laserskanningsmikroskop for å bestemme volumet av muskelvev og antall muskelfibre som er tilstede. Effektive tilnærminger for måling av cellenummer og størrelse hos levende dyr over tid beskrives og valideres mot mer krevende segmenteringsmetoder. Metoder beskrives som tillater kontroll av muskelelektrisk, og dermed kontraktil, aktivitet. Tap av skjelettmuskulaturkontraktil aktivitet reduserte muskelveksten sterkt. Hos larver beskrives en protokoll som tillater gjeninnføring av mønstret elektrisk fremkalt kontraktil aktivitet. De beskrevne metodene minimerer effekten av interindividuell variabilitet og vil tillate analyse av effekten av elektriske, genetiske, medikamentelle eller miljømessige stimuli på en rekke cellulære og fysiologiske vekstparametere i sammenheng med den levende organismen. Langtidsoppfølging av de målte effektene av en definert tidlig livsintervensjon på enkeltpersoner kan senere utføres.
Introduction
Regulert vevsvekst, som omfatter økning i cellenummer (hyperplasi) og / eller cellestørrelse (hypertrofi), er en avgjørende faktor i utvikling, regenerering og økologisk og evolusjonær tilpasning. Til tross for store fremskritt innen molekylærgenetisk forståelse av både celle- og utviklingsbiologi de siste tiårene, er mekanistisk forståelse av regulering av vev og organstørrelse fortsatt i sin barndom. En grunn til denne lacuna i kunnskap er vanskeligheten med å kvantifisere vevsvekst i levende organismer med nødvendig romlig og tidsmessig nøyaktighet.
Ulike aspekter ved vekst av hele organismer kan måles gjentatte ganger over tid, og avslører vekstkurver for hvert individ 1,2,3,4,5. Stadig mer sofistikerte skanningsmetoder, for eksempel dobbel røntgenabsorptiometri (DXA), datastyrt tomografi (CT) og magnetisk resonansavbildning (MR), tillater sporing av vekst av hele organer og andre kroppsregioner (for eksempel individuelle identifiserte skjelettmuskler) hos enkeltindivider, både menneskelige og i modellorganismer 6,7,8,9,10 . Imidlertid har disse metodene ennå ikke oppløsningen til å avsløre individuelle celler, og dermed har koblingene mellom cellulær oppførsel og vevsnivåvekst vært vanskelig å skjelne. For å gjøre slike koblinger har tradisjonelle studier ofte stolt på kohorter av lignende individuelle dyr, hvorav noen blir ofret på suksessive tidspunkter og deretter analysert i cytologisk detalj. Slike tilnærminger krever gjennomsnittlig de observerte endringene på tvers av grupper av (helst like, men likevel variable) individer og lider dermed av mangel på tidsmessig og romlig oppløsning, noe som gjør det vanskelig å finne korrelerte hendelser på mobilnivå som tyder på årsak og virkning.
Studier på virvelløse modellorganismer, først i C. elegans og D. melanogaster, har omgått disse problemene ved å utvikle optisk mikroskopi for å oppnå cellulær oppløsning og nøyaktig måle vekst over tid hos enkeltpersoner. Slike studier har avslørt påfallende invariant cellelinjeadferd i veksten av disse små modellorganismene 11,12,13,14,15,16,17. Imidlertid har mange dyr, inkludert alle vertebrater, ubestemte cellelinjer, og kontrollerer vevsvekst ved mystiske tilbakemeldingsprosesser som tjener til å gjøre det genetisk kodede vekstprogrammet til en funksjonell tredimensjonal organisme med alle dets bestanddeler vev og organer passende tilpasset i størrelse. For å forstå disse komplekse vekstprosessene er det ønskelig å avbilde hele vev eller organer over tid hos enkeltpersoner som kan manipuleres eksperimentelt ved genetiske, farmakologiske eller andre inngrep på et tidspunkt for valg og effekten analyseres deretter.
Hver vertebrat skjelettmuskel har en definert størrelse, form og funksjon, og godt karakteriserte interaksjoner med tilstøtende vev, som bein, sene og nerver. Noen muskler er små, ligger rett under huden og er derfor gode kandidater for høyoppløselige bildestudier. I likhet med de fleste organer vokser hver muskel gjennom embryonal, postnatal og juvenilt liv, før de når en stabil voksenstørrelse. Muskel har imidlertid også en unik evne til å endre størrelse i voksenlivet, avhengig av bruk og ernæring18, og denne egenskapen har stor innvirkning på organismal fitness, sportslige prestasjoner og selvstendig liv. Tap av muskelmasse og funksjon i alderdommen, sarkopeni, er et problem med økende bekymring for samfunn som står overfor en aldrende befolkning 19,20,21.
Vi og andre har fokusert på veksten av definerte blokker av skjelettmuskelvev i den segmentalt repeterende kroppen av sebrafisklarver, som et tilsynelatende lukket system som inneholder flere hundre celler der vevsvekst, vedlikehold og reparasjon kan observeres og manipuleres 22,23,24,25,26. Mens noe kvantitativt arbeid tidligere er rapportert 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, er ingen detaljert og validert metode for å måle muskelvekst i cellulær detalj i individuelle virveldyrorganismer over tid tilgjengelig. Her beskrives en effektiv protokoll for hvordan man utfører slike gjentatte målinger, sammen med validering, og et eksempel på bruken av den til å analysere endringer i både hypertrofisk og hyperplastisk vekst som svar på endret elektrisk aktivitet er gitt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her rapporterer vi en metode for nøyaktig og effektiv estimering av muskelvolumet til levende sebrafisklarver i stadier eller i genetiske varianter der pigmentering ikke er et stort hinder for avbildning og når forbigående anestesi og/eller immobilisering tolereres godt. Mens vi har brukt laserskanning konfokal mikroskopi, er de beskrevne tilnærmingene anvendelige for spinnende diskkonfokal eller lysarkmikroskopi og til enhver annen metode som skaper stabler med bilder på forskjellige fokalplan. En rekke stadig mer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne står i dyp gjeld til innsatsen til Hughes lab medlemmer Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin, og Vladimir Snetkov for utvikling av de beskrevne protokoller, og til Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau og Peter Currie for deling plasmids eller sebrafisk linjer. SMH er forsker i Medisinsk forskningsråd (MRC) med programstipend G1001029, MR/N021231/1 og MR/W001381/1support. MA holdt et MRC doktorgradsprogram PhD Studentship fra King’s College London. Dette arbeidet dro nytte av trigonometriske innspill fra David M. Robinson, forsker, mentor og venn.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish – Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book – A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
