Realtid och upprepad mätning av skelettmuskeltillväxt hos enskilda levande zebrafiskar som utsätts för förändrad elektrisk aktivitet
Summary
Optisk klarhet är en stor fördel för cellbiologiskt och fysiologiskt arbete i zebrafiskar. Robusta metoder för mätning av celltillväxt hos enskilda djur beskrivs som möjliggör nya insikter om hur tillväxt av skelettmuskulaturen och närliggande vävnader integreras med helkroppstillväxt.
Abstract
Ett antal metoder kan användas för att visualisera enskilda celler i hela kroppen av levande embryonala, larvala eller juvenila zebrafiskar. Vi visar att levande fisk med fluorescerande märkta plasmamembran kan skannas i ett konfokalt laserscanningsmikroskop för att bestämma volymen av muskelvävnad och antalet närvarande muskelfibrer. Effektiva metoder för mätning av cellantal och storlek hos levande djur över tid beskrivs och valideras mot mer mödosamma segmenteringsmetoder. Metoder beskrivs som möjliggör kontroll av muskelelektrisk, och därmed kontraktil, aktivitet. Förlust av skelettmuskelkontraktil aktivitet minskade kraftigt muskeltillväxten. I larver beskrivs ett protokoll som möjliggör återinförande av mönstrad elektriskt framkallad kontraktil aktivitet. De beskrivna metoderna minimerar effekten av interindividuell variabilitet och möjliggör analys av effekten av elektriska, genetiska, läkemedels- eller miljöstimuli på en mängd olika cellulära och fysiologiska tillväxtparametrar i samband med den levande organismen. Därefter kan långtidsuppföljning av de uppmätta effekterna av en definierad tidig intervention på individer utföras.
Introduction
Reglerad vävnadstillväxt, innefattande ökning av cellantal (hyperplasi) och / eller cellstorlek (hypertrofi), är en avgörande faktor för utveckling, regenerering och ekologisk och evolutionär anpassning. Trots enorma framsteg i molekylärgenetisk förståelse av både cell- och utvecklingsbiologi under de senaste decennierna är mekanistisk förståelse av regleringen av vävnad och organstorlek fortfarande i sin linda. En orsak till denna brist i kunskap är svårigheten att kvantifiera vävnadstillväxt i levande organismer med nödvändig rumslig och tidsmässig noggrannhet.
Olika aspekter av tillväxt av hela organismer kan mätas upprepade gånger över tiden och avslöjar tillväxtkurvor för varje individ 1,2,3,4,5. Allt mer sofistikerade skanningsmetoder, såsom dubbel röntgenabsorptiometri (DXA), datortomografi (CT) och magnetisk resonanstomografi (MRI), möjliggör spårning av tillväxt av hela organ och andra kroppsregioner (till exempel individuella identifierade skelettmuskler) hos enskilda individer, både mänskliga och i modellorganismer 6,7,8,9,10 . Dessa metoder har dock ännu inte upplösningen att avslöja enskilda celler och därmed har kopplingarna mellan cellulära beteenden och vävnadsnivåtillväxt varit svåra att urskilja. För att göra sådana kopplingar har traditionella studier ofta förlitat sig på kohorter av liknande enskilda djur, varav några offras vid successiva tidpunkter och sedan analyseras i cytologisk detalj. Sådana tillvägagångssätt kräver medelvärde av de observerade förändringarna över grupper av (helst liknande, men ändå variabla) individer och lider därmed av brist på tidsmässig och rumslig upplösning, vilket gör det svårt att hitta korrelerade händelser på cellnivå som tyder på orsak och verkan.
Studier på ryggradslösa djurs modellorganismer, initialt i C. elegans och D. melanogaster, har kringgått dessa problem genom att utveckla optisk mikroskopi för att uppnå cellulär upplösning och noggrant mäta tillväxt över tid hos enskilda individer. Sådana studier har avslöjat påfallande invarianta celllinjebeteenden i tillväxten av dessa små modellorganismer 11,12,13,14,15,16,17. Men många djur, inklusive alla ryggradsdjur, har obestämda cellinjer och kontrollerar vävnadstillväxt genom mystiska återkopplingsprocesser som tjänar till att förvandla det genetiskt kodade tillväxtprogrammet till en funktionell tredimensionell organism med alla dess beståndsdelar och organ som är lämpligt matchade i storlek. För att förstå dessa komplexa tillväxtprocesser är det önskvärt att avbilda hela vävnader eller organ över tid hos enskilda individer som experimentellt kan manipuleras genom genetiska, farmakologiska eller andra ingrepp vid en valfri tidpunkt och effekten analyseras därefter.
Varje ryggradsdjur skelettmuskel har en definierad storlek, form och funktion, och väl karakteriserade interaktioner med intilliggande vävnader, såsom ben, sena och nerver. Vissa muskler är små, ligger precis under huden och är därför bra kandidater för högupplösta avbildningsstudier. I likhet med de flesta organ växer varje muskel under embryonalt, postnatalt och juvenilt liv innan de når en stabil vuxenstorlek. Muskler har dock också en unik förmåga att ändra storlek under vuxenlivet, beroende på användning och näring18, och den här egenskapen har stor inverkan på organismens kondition, sportprestanda och självständigt boende. Förlust av muskelmassa och funktion i ålderdom, sarkopeni, är en fråga av ökande oro för samhällen som står inför en åldrande befolkning 19,20,21.
Vi och andra har fokuserat på tillväxten av definierade block av skelettmuskelvävnad i den segmentupprepande kroppen av zebrafisklarver, som ett till synes slutet system som innehåller flera hundra celler där vävnadstillväxt, underhåll och reparation kan observeras och manipuleras22,23,24,25,26. Medan vissa kvantitativa arbeten tidigare har rapporterats 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, finns ingen detaljerad och validerad metod för att mäta muskeltillväxt i cellulär detalj hos enskilda ryggradsdjursorganismer över tid tillgänglig. Här beskrivs ett effektivt protokoll för hur man utför sådana upprepade mätningar, tillsammans med validering, och ett exempel på dess användning för att analysera förändringar i både hypertrofisk och hyperplastisk tillväxt som svar på förändrad elektrisk aktivitet tillhandahålls.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här redovisar vi en metod för noggrann och effektiv uppskattning av muskelvolymen hos levande zebrafisklarver i stadier eller i genetiska varianter där pigmentering inte är ett stort hinder för avbildning och när övergående anestesi och/eller immobilisering tolereras väl. Medan vi har använt laserscanning konfokalmikroskopi, är de beskrivna metoderna tillämpliga på spinnande skivkonfokal eller ljusarkmikroskopi och på alla andra metoder som skapar staplar av bilder vid distinkta fokalplan. En rad alltmer so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna står i djup tacksamhetsskuld till Hughes laboratoriemedlemmar Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin och Vladimir Snetkov för utveckling av de beskrivna protokollen, och till Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau och Peter Currie för att dela plasmider eller zebrafisklinjer. SMH är en medicinsk forskningsrådsforskare (MRC) med programbidrag G1001029, MR / N021231 / 1 och MR / W001381 / 1support. MA hade en MRC Doctoral Training Programme doktorandtjänst från King’s College London. Detta arbete gynnades av den trigonometriska insatsen från David M. Robinson, forskare, mentor och vän.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish – Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book – A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
