רכש ודה-סלוליזציה של חולדות אחוריות באמצעות ביוריאקטור מבוסס ex vivo perfusion עבור allotransplantation מרוכב וסקולרי
Summary
אנו מתארים את הטכניקה הכירורגית ואת תהליך הדה-סלוליזציה של חולדות מרוכבות. דה-סלוליזציה מתבצעת באמצעות נתרן דודציל סולפט בריכוז נמוך באמצעות מערכת פרפוזיה של מכונת ex vivo.
Abstract
חולים עם פציעות טראומטיות קשות ואובדן רקמות זקוקים לשחזור כירורגי מורכב. אלוטרנספלנטציה מרוכבת וסקולרית (VCA) היא דרך שחזור מתפתחת להעברת רקמות מרובות כתת-יחידה מרוכבת. למרות האופי המבטיח של VCA, הדרישות ארוכות הטווח של דיכוי חיסוני הן מגבלה משמעותית בשל הסיכון המוגבר לממאירויות, רעילות איברי קצה וזיהומים אופורטוניסטיים. הנדסת רקמות של פיגומים מרוכבים תאיים היא חלופה פוטנציאלית בהפחתת הצורך בדיכוי חיסוני. כאן מתוארת ההצטיידות של חולדה אחורית ודה-צלולריזציה שלה לאחר מכן באמצעות נתרן דודציל סולפט (SDS). אסטרטגיית הרכש המוצגת מבוססת על עורק הירך המשותף. נבנתה מערכת ביו-ריאקטור מבוססת זלוף מכונה ושימשה לדה-סלוליזציה של ה-ex vivo של ה-hindlimb. בוצעה דה-סלוליזציה מוצלחת של הזליפה, וכתוצאה מכך נוצר מראה לבן שקוף דמוי האחורי. נצפתה רשת כלי דם שלמה, ניתנת להעברה, לאורך כל החלק האחורי. ניתוחים היסטולוגיים הראו את הסרת התכולה הגרעינית ואת שימור ארכיטקטורת הרקמות בכל תאי הרקמות.
Introduction
VCA הוא אופציה מתפתחת עבור חולים הזקוקים לשחזור כירורגי מורכב. פציעות טראומטיות או כריתות גידול גורמות לאובדן רקמה נפחית שקשה לשחזר. VCA מציע השתלה של רקמות מרובות כגון העור, העצם, השרירים, העצבים וכלי הדם כשתל מורכב מתורם למקבל1. למרות אופיו המבטיח, VCA מוגבל בשל משטרים מדכאי חיסון ארוכי טווח. שימוש בתרופות כאלה לכל החיים גורם לסיכון מוגבר לזיהומים אופורטוניסטיים, ממאירויות ורעילות איברים סופית 1,2,3. כדי לעזור להפחית ו/או לבטל את הצורך בדיכוי חיסוני, פיגומים מהונדסים רקמות המשתמשים בגישות דה-סלוליזציה עבור VCA מראים הבטחה גדולה.
דה-סלוליזציה של רקמות כרוכה בשמירה על מבנה המטריצה החוץ-תאית תוך הסרת התכולה התאית והגרעינית. פיגום מתכלה זה יכול להיות מאוכלס מחדש עם תאים ספציפיים לחולה4. עם זאת, שימור רשת ECM של רקמות מרוכבות הוא אתגר נוסף. זאת בשל נוכחותם של סוגי רקמות מרובים עם צפיפויות רקמה שונות, ארכיטקטורות ומיקומים אנטומיים בתוך פיגום. הפרוטוקול הנוכחי מציע טכניקה כירורגית ושיטת דה-סלוליזציה עבור חולדה אחורית. זהו מודל הוכחת היתכנות ליישום טכניקה זו של הנדסת רקמות על רקמות מרוכבות. זה יכול גם להניע את המאמצים הבאים לחדש רקמות מרוכבות באמצעות recellularization.
Protocol
Representative Results
Discussion
עכברושים אחוריים שימושיים כמודלים ניסיוניים ב-VCA5. הנדסת רקמות של פיגומים תאיים מייצגת את הצעד הראשון בטיפול בחסרונות של משטרי דיכוי חיסוני ארוכי טווח הקשורים ל-VCA. השימוש בשתלים מרוכבים מהווה אתגר נוסף בהתחשב בנוכחותן של רקמות מרובות, שלכל אחת מהן תכונות תפקודיות, אימונוגניו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
איור 3A נוצר בשנת BioRender.com.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade – #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
References
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
