Summary
I dette arbeidet ble det utviklet en rask, sensitiv og bærbar deteksjonsmetode for Candidatus Liberibacter asiaticus basert på rekombinasepolymeraseforsterkning kombinert med CRISPR-Cas12a.
Abstract
Tidlig påvisning av Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) av sitrusdyrkere letter tidlig intervensjon og forhindrer spredning av sykdom. En enkel metode for rask og bærbar Huanglongbing (HLB) diagnose presenteres her som kombinerer rekombinase polymeraseforsterkning og en fluorescerende reporter som benytter nukleaseaktiviteten til det grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert 12a (CRISPR-Cas12a) system. Følsomheten til denne teknikken er mye høyere enn PCR. Videre viste denne metoden lignende resultater som qPCR når bladprøver ble brukt. Sammenlignet med konvensjonelle CLas-deteksjonsmetoder, kan deteksjonsmetoden som presenteres her fullføres på 90 minutter og fungerer i en isotermisk tilstand som ikke krever bruk av PCR-maskiner. I tillegg kan resultatene visualiseres gjennom en håndholdt fluorescerende deteksjonsenhet i feltet.
Introduction
Huanglongbing (HLB) er en av de mest problematiske sitrussykdommene i verden1. HLB er forårsaket av de floemkoloniserende og kresne bakteriene Candidatus Liberibacter spp., inkludert Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus og Ca. L. americanus 2. Den mest utbredte HLB-assosierte arten i Kina og USA er CLas, som overføres av asiatiske sitruspsyllider (Diaphorina citri) eller gjennom podning3. Etter å ha blitt smittet av CLas, viser sitrustrær vekstnedgang tildøden 2. De vanlige symptomene på sitrusblader infisert med CLas er flekkete mottle, grønne øyer (små sirkulære mørkegrønne prikker), hevede korketårer på tykkere og skinnende blader og nonuniform gulningsskudd2. I tillegg virker frukt smittet med CLas liten og skjev2.
Siden ingen sitrussort er motstandsdyktig mot HLB og det ikke finnes noen terapeutisk kur for HLB, krever forebygging av HLB karantene og isolering av CLas-positive sitrustrær 2,3. Derfor er tidlig deteksjon avgjørende for overvåking og karantene for å forhindre spredning av CLas og minimere økonomiske tap3. I tillegg er sensitiv CLas-deteksjon nødvendig på grunn av den lave titeren av CLas i planter i det tidlige infeksjonsstadiet3. I Kina utføres CLas-deteksjon vanligvis av visse sertifiserte testsentre. Imidlertid tar deteksjonsprosessen vanligvis minst 1 uke, og deteksjonsgebyret er dyrt. Derfor, for å bidra til å overvåke forekomsten av HLB
Ulike teknologier har blitt brukt til å diagnostisere HLB 4,5,6,7,8,9. Polymerasekjedereaksjon (PCR) og kvantitativ PCR (qPCR) er de mest brukte verktøyene for CLas-deteksjon på grunn av deres høye følsomhet og spesifisitet 4,5. Imidlertid er disse teknologiene avhengige av dyre instrumenter og høyt kvalifisert personell. I tillegg har flere isotermiske amplifikasjonsmetoder, som sløyfemediert isotermisk forsterkning (LAMP), blitt utviklet som attraktive alternativer til konvensjonelle PCR-metoder på grunn av deres enkelhet, hurtighet og lave kostnader 8,9,10. Det er imidlertid utfordrende å bruke dem til å nøyaktig oppdage CLas på grunn av de ikke-spesifikke forsterkningssignalene, noe som kan forårsake falske positive resultater.
RNA-guidet CRISPR / Cas (gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert) endonukleasebasert nukleinsyredeteksjon er utviklet som en neste generasjons molekylær diagnostikkteknologi på grunn av sin høye følsomhet, spesifisitet og pålitelighet11,12,13,14. Disse CRISPR / Cas-diagnostikkteknologiene er avhengige av sikkerhetskjerneaktiviteten til Cas-proteiner for å spalte enkeltstrenget DNA (ssDNA) modifisert med en fluorescerende reporter og en fluorescensslukker i hver ende av oligonukleotidene, samt en fluorescensdeteksjonsenhet for å fange den frigjorte fluorescerende reporteren11,12 . Nukleaseaktiviteten til flere Cas-effektorer aktivert av CRISPR RNA (crRNA) måldupleks kan ukritisk spalte det omkringliggende ikke-mål ssDNA11. CRISPR-Cas12a (også kalt Cpf 1), et klasse 2 type V-A CRISPR/Cas-system, demonstrerer flere fordeler sammenlignet med Cas9, for eksempel lavere mismatchtoleranse og større spesifisitet13. Cas12a / crRNA-systemet har blitt brukt for sensitiv og spesifikk påvisning av nukleinsyrene til humane patogener og fytopatogener 14,15,16,17,18. Derfor bør bruk av Cas12a / crRNA-systemet muliggjøre nøyaktig og sensitiv deteksjon av nukleinsyren av CLas.
Cas12a alene er ikke teoretisk følsomt nok til å oppdage lave nivåer av nukleinsyrer. Derfor, for å forbedre deteksjonsfølsomheten, kombineres CRISPR-Cas12a-deteksjon vanligvis med et isotermisk forsterkningstrinn14,15. Rekombinase polymeraseforsterkning (RPA) muliggjør sensitiv og rask isotermisk DNA-amplifisering i et temperaturområde fra 37 °C til 42 °C19.
En deteksjonsplattform kalt DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) som kombinerer DNase-aktiviteten til Cas12a med RPA og en fluorescensavlesning, er nylig utviklet12 og har vist seg å oppdage nukleinsyre med høyere følsomhet20. Videre kan fluorescenssignalet som sendes ut fra de positive prøvene observeres gjennom en håndholdt fluorescensdeteksjonsanordning i feltet.
Siden vi forsterket DNA med RPA, designet crRNA rettet mot fem-kopi nrdB (ribonukleotidreduktase β- subenhet) -genet spesifikt for CLas21, og benyttet DNase-aktiviteten til Cas12a-proteinet, kalte vi denne CLas-deteksjonsmetoden CLas-DETECTR. Sammenlignet med eksisterende CLas-deteksjonsmetoder er CLas-DETECTR rask, nøyaktig, sensitiv og distribuerbar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruksjon av CLas-DETECTR
MERK: Konstruksjonen av CLas-DETECTR er en fire-trinns prosess: løsningsforberedelse, sitrus total DNA-isolasjon, isotermisk DNA-amplifisering og resultatvisualisering. Skjemaet til CLas-DETECTR-analysen er illustrert i figur 1A.
- Løsning forberedelse
- Forbered buffer A: 20 mM NaOH i 6% PEG 200. For 100 ml, tilsett 113 mg NaOH og 6 g PEG 200 i 80 ml H2O i en flaske. Inkuber flasken i et vannbad ved 60 °C til hele PEG 200 er oppløst. Tilsett deretter H2O til et volum på 100 ml.
- Klargjør løsning B: For hver reaksjon tilsettes 10 μL RPA-buffer, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr og 3,9 μL ddH2O til et endelig volum på 15,5 μL.
MERK: F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr er primerne som brukes i analysen mot nrdB-genet . Se tabell 1 for sekvensen. - Klargjør løsning C: For hver reaksjon, tilsett 1 μL ssDNA-reporter, 3 μL NEB-buffer 3,1, 1 μL crRNA, 4 μL Cas12a og 11 μL ddH2O til et endelig volum på 20 μL.
MERK: Hvis det er mange prøver å oppdage, lag et stort volum av løsning B og løsning C, og aliquot senere.
- Sitrus total DNA-isolasjon
MERK: For å spare tid og gjøre denne metoden egnet for felt-CLas-deteksjon, ble den alkaliske polyetylenglykol (PEG)-baserte tilnærmingen brukt til å oppnå rå planteekstrakter for DNA-amplifisering22,23- Sitrusblader ble brukt i denne protokollen. Først slår du fem bladskiver fra et blad. Deretter legger du bladskivene i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og tilsett 200 μL buffer A.
MERK: Rengjør bladene først i felten hvis det er støv som dekker dem. Bladskivene kan klippes med lokket på 1,5 ml røret for å unngå krysskontaminering. Andre sitrusvev, som røtter, stengler, frukt og blomster, kan også brukes i denne protokollen. - Mal bladskivene manuelt til de er glatte med en plaststang.
- La røret stå uforstyrret i 10 min. Bruk deretter supernatanten for DNA-amplifisering.
MERK: Analysen kan settes på pause her, og de rå planteekstraktene som ble ekstrahert ved alkalisk-PEG-metoden, kan lagres ved -20 ° C i minst 1 år. Newhall søt appelsin (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) trær vist i videoen ble dyrket i en gryte fylt med en blanding av 9/3/1 (v / v / v) torvjord / vermikulitt / perlit og vedlikeholdt i et glasshus som ligger på campus av Gannan Normal University, Jiangxi, Kina. De HLB-infiserte trærne ble inokulert ved poding med CLas-positive Newhall-knopper. De HLB-infiserte og HLB-infiserte trærne ble bekreftet av PCR. CLas ble påvist ved bruk av primerparet (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) rettet mot det CLas-spesifikke markørgenet nrdB. På den andre siden kan karakteristiske HLB-symptomer, flekkete mottle og gulningsblader finnes på CLas-positive, men ikke på CLas-negative trær.
- Sitrusblader ble brukt i denne protokollen. Først slår du fem bladskiver fra et blad. Deretter legger du bladskivene i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og tilsett 200 μL buffer A.
- Isotermisk DNA-forsterkning
- Tilsett 1 μL av supernatanten fra trinn 1.2.3 og 1 μL MgOAc (14 mM sluttkonsentrasjon) i løsning B og bland godt.
- I laboratoriet inkuberer du dem i en enkel inkubator ved 37 °C i 15 minutter.
MERK: Hold rørene i hånden i 15 minutter i feltet. Det anbefales også å inkubere rør i en enkel inkubator ved 37 °C i 15 minutter hvis forholdene tillater det.
- Visualisering av resultater
- Tilsett 10 μL av blandingen fra trinn 1.3.2 i oppløsning C og bland godt.
- Inkuber dem i en inkubator på 37 °C i 60 minutter.
- Bruk vernebriller og observer det grønne fluorescenssignalet som frigjøres fra ssDNA-reporteren merket med 5 '6-Fluorescein ved 5' og fluorescensslukkeren ved 3' gjennom en håndholdt fluorescerende deteksjonsenhet (eksitasjonsbølgelengde: 440 nm, utslippsbølgelengde: 500 nm).
MERK:grønt fluorescenssignal kan vare i flere dager, det er bedre å
FORSIKTIG: Lyset som sendes ut av fluorescensdeteksjonsenheten er skadelig for øynene. Sørg for å bruke vernebriller før du observerer resultatene.
2. Spesifisitetstest
MERK: For å teste spesifisiteten til CLas-DETECTR, ble rhizosfærebakterien Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) og Burkholderia stabilis stamme 1440 isolert i laboratoriet24 utsatt for CLas-DETECTR-testen.
MERK: Candidatus Liberibacter (CLas) kan ikke dyrkes. Man kan bare få CLas DNA fra ekstraksjon av genomisk DNA fra sitrusvev infisert med CLas. Xcc er årsaksmidlet til en annen viktig sitrus sykdom, sitrus canker. Burkholderia stabilis stamme 1440 er en anti-Xcc bakterie isolert i laboratoriet. Derfor ble rene stammer for alle disse tre bakteriene brukt.
- Trekk ut bakteriegenomisk DNA (gDNA) ved hjelp av et bakterielt genomisk DNA-ekstraksjonssett etter produsentens protokoll. Bruk vann som en negativ kontroll.
- Utfør PCR ved bruk av 0,2 ml PCR-rørstrimler med optiske kapper i en 25 μL reaksjonsblanding som inneholder 1 μL F-RPA-RNRf, 1 μL R-RPA-RNRr, 12,5 μL Ex Taq versjon 2,0 pluss fargestoff, 1 μL DNA-mal og 9,5 μL H2O.
- Bruk følgende reaksjonsbetingelser for termisk syklus: 1 min ved 98 °C; etterfulgt av 35 sykluser på 10 s ved 98 °C, 30 s ved 55 °C, 15 s ved 72 °C; deretter 10 min ved 72 °C; og hold ved 16 °C.
- Kjør PCR-produktene på 1% agarosegel ved 120 V i 15 minutter.
- Utfør qPCR i en 20 μL reaksjonsblanding inneholdende 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr, 10 μL 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL av DNA-malen og 7,4 μL H2O.
- Bruk følgende termiske syklusreaksjonsbetingelser: 30 s ved 95 °C; etterfulgt av 45 sykluser på 5 s ved 95 °C og 32 s ved 60 °C; og deretter et smeltekurvetrinn på 15 s ved 95 °C, 1 min ved 60 °C og 15 s ved 95 °C.
- Inkluder tre tekniske repetisjoner i hver repetisjon.
- Utfør metoden CLas-DETECTR ved å følge trinn 1.1–1.4.
3. Sammenligning av følsomhet
- For å teste følsomheten til CLas DETECTR, påvis en serie CLas DNA-fragmentfortynninger ved bruk av PCR, CLas-DETECTR og qPCR, som beskrevet ovenfor.
- Forsterk et DNA-segment med en lengde på 1,060 bp fra nrdB ved bruk av primersettet F-RNR og R-RNR i en 100 μL reaksjonsblanding som inneholder 4 μL F-RNR, 4 μL R-RNR, 50 μL PrimeSTAR Max Premix, 2 μL DNA-mal og 40 μL H2O, etter de termiske syklusreaksjonsbetingelsene (30 s ved 98 °C; etterfulgt av 35 sykluser på 10 s ved 98 °C, 15 s ved 55 °C, 30 s ved 72 °C; deretter 10 min ved 72 °C; og hold ved 16 °C).
MERK: NgB(ribonukleotidreduktase β- subenhet) genet er spesifikt for CLas21. Man kan enkelt få nrdB-amplikon fra CLas-positiv sitrus gDNA ved hjelp av primersettet F-RNR og R-RNR. Primersettet F-RNR og R-RNR forsterker et 1,060 bp nrdB-fragment, mens primersettet F-RPA-RNR og R-RPA-RNR forsterker et 104 bp-fragment av nrdB-genet, som er en del av 1,060 bp nrdB-fragmentet . - Rens PCR-produktene med et DNA-gelekstraksjonssett etter produsentens håndbok.
- Fortynn PCR-produktene som inneholder nrdB-amplikoner med sterilisert ddH2O.
- Beregn kopinummeret til nrdB-genet ved hjelp av kommersielt tilgjengelig online DNA-kopinummer og fortynningskalkulator.
- Klargjør DNA-fortynninger som inneholder 2,01 × 106 kopier/μL, 2,01 × 105 kopier/μL, 2,01 × 104 kopier/μL, 2,01 × 103 kopier/μL, 2,01 × 10 2 kopier/μL, 2,01 × 101 kopier/μL, 2,01 × 100 kopier/μL og2,01 × 10−1 kopier/μL CLas DNA-fragment.
4. Deteksjon av prøver
MERK: Etter spesifisitets- og følsomhetstesten ble CLas-DETECTR-metoden brukt til å oppdage tilstedeværelsen av CLas i feltbladprøver samlet inn fra Newhall søte appelsintrær dyrket i germplasm ressursbarnehage på campus av Gannan Normal University, Jiangxi, Kina. En qPCR ble utført for å verifisere resultatene.
- Test totalt 15 trær. Bruk vann som en negativ kontroll.
- Utfør CLas-DETECTR- og qPCR-metodene som beskrevet ovenfor.
MERK: På grunn av de ujevne fordelingsegenskapene til CLas i sitrus, ble blader som viser HLB-symptomer samlet som en prioritet. Hvis et tre så sunt ut, ble bladene samlet tilfeldigCLas-DETECTR-systemet fungerer riktig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her har vi beskrevet en bærbar plattform, CLas-DETECTR, som kombinerer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemene for å diagnostisere HLB i felten. Skjemaet til CLas-DETECTR er illustrert i figur 1A.
Når bladprøver fra de HLB-infiserte og HLB-infiserte Newhall-trærne (figur 1B), der tilstedeværelsen av CLas ble bekreftet av PCR (figur 1C), ble utsatt for CLas-DETECTR-testen, ble det sett et grønt fluorescenssignal i den HLB-infiserte prøven, men ikke i den HLB-infiserte prøven og negativ kontroll (figur 1D).
Vi bestemte spesifisiteten til CLas-DETECTR ved bruk av nukleinsyrer ekstrahert fra andre bakterier. Primersettet med F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr brukt i CLas-DETECTR-analysen ble også brukt i PCR og qPCR. Et bånd kunne sees i agarosegelelektroforese når det ble forsterket ved bruk av CLas-positivt sitrusblad gDNA, men ikke annet bakterielt gDNA i PCR-analysene (figur 2A). I qPCR-analysene var gjennomsnittlig terskelsyklusverdi (Ct) for CLas 24 ± 0,7, mens gjennomsnittlige Ct-verdier for A. tumefaciens GV3101, Xcc og B. stabilis-stamme 1440 var henholdsvis 38 ± 0,7, 39 ± 1,4 og 39 ± 0,7 (figur 2B). Vanligvis anses resultatet som negativt når Ct-verdien er høyere enn 38. Disse resultatene viser at primerparet F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr er spesifikke for CLaer. I CLas-DETECTR-analysen viste bare CLas gDNA grønne fluorescenssignaler; gDNA ekstrahert fra A. tumefaciens GV3101, Xcc og B. stabilis-stamme 1440 gjorde det ikke (figur 2C), noe som betyr at CLas-DETECTR kan oppdage CLas spesifikt.
Vi testet også følsomheten til CLas-DETECTR ved hjelp av en serie CLas DNA-fortynninger. PCR kunne påvise 2,01 × 102 kopier/μL (figur 3A). På den annen side kunne CLas-DETECTR detektere 2,01 × 100 kopier/μL, noe som tyder på at dette er levedyktig som sensitivt feltdiagnostisk (figur 3B). qPCR kunne påvise 2,01 × 10−1 kopier/μL, men Ct-verdien var høyere enn 36 (figur 3C). CLas-DETECTR er derfor to størrelsesordener mer følsomme enn tradisjonell PCR og en størrelsesorden mindre følsom enn qPCR når fortynnede amplikoner brukes (figur 3).
Til slutt undersøkte vi muligheten for CLas-DETECTR for feltprøver og sammenlignet følsomheten med qPCR, en etablert, sensitiv nukleinsyredeteksjonsmetode21. Vanligvis betyr en Ct-verdi av CLas-deteksjon ved qPCR høyere enn 36 at CLas-konsentrasjonen er mindre enn 2,01 × 10−1 kopier/μL, som er en svært lav konsentrasjon (figur 3C). Blant de 15 prøvene var Ct-verdien av prøvene 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 og 14 oppdaget av qPCR mindre enn 36, og tilsynelatende grønne fluorescenssignaler ble observert (figur 4). På den annen side, når Ct-verdiene for prøvene 6, 7, 9, 12 og 15 oppdaget av qPCR var ubestemte, ble det ikke observert grønne fluorescenssignaler (figur 4). Videre ble svake grønne fluorescenssignaler observert når Ct-verdiene i prøve 5 og prøve 11 påvist av qPCR var høyere enn 36 (figur 4). Resultatene tyder på at plattformen vår er et raskt, robust og følsomt verktøy for HLB-diagnose i felt.
| Nei | Navn | Sekvens (5 'til 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrCrUrCrCrUrArArGrGrUrGrUrArArUrUrGrCrArArGrGrCrGrGrArUrUrUrCrGrGrGrArG | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
Tabell 1: Nukleinsyre brukt i denne studien. SsDNA-FQ er enkeltstrenget DNA merket med 5 '6-FAM (Fluorescein) ved 5' og fluorescensslukkeren Black Hole Quencher 1 (BHQ1) ved 3'. Forkortelser: F = fluorescerende reporter; Q = fluorescensslukker.
Figur 1: Design og validering av CLas-DETECTR. (A) Skjematisk av CLas-DETECTR-analysen. Trinn 1: Klargjør buffer A som inneholder 20 mM NaOH i 6% PEG 200 for rask gDNA-ekstraksjon; oppløsning B inneholdende 10 μL RPA-buffer, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL F-RPA-RNRr og 3,9 μL ddH2O i hver reaksjon for isotermisk DNA-amplifisering; oppløsning C inneholdende 1 μL ssDNA-reporter, 3 μL NEB-buffer 3,1, 1 μL crRNA rettet mot nrdB, 4 μL Cas12a og 11 μL ddH2O i hver reaksjon for fluorescerende reporterfrigjøring. Trinn 2: Fem bladskiver stanset fra blader ble brukt til å trekke ut sitrus totalt DNA med 200 μL buffer A. Trinn 3: De CLas-spesifikke nukleinsyrene ble forsterket ved hjelp av primerne F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr rettet mot CLas-spesifikt markørgen nrdB i løsning B med 1 μL supernatant fra trinn 2 og 1 μL MgOAc ved 37 ° C i 15 min. Trinn 4: Løsning C med 10 μL av blandingen fra trinn 3 ble inkubert ved 37 °C i 60 minutter, og det grønne fluorescenssignalet ble observert gjennom en håndholdt fluorescerende deteksjonsanordning. Den ssDNA-FQ ble merket med 5 '6-FAM (Fluorescein) på 5 'og en fluorescens quencher Black Hole Quencher 1 (BHQ1) på 3 '. Forkortelser: F = fluorescerende reporter; Q = fluorescensslukker. (B) Det HLB-infiserte treet (venstre) viser flekkete mottle og gule blader, men det HLB-uinfiserte treet (høyre) ser grønt ut. (C) Tilstedeværelsen av CLas ble bekreftet ved bruk av primerparet F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr. (D) Den HLB-infiserte prøven viser grønne fluorescenssignaler, mens HLB-uinfiserte og H2O ikke gjør det i CLas-DETECTR-analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Testing av spesifisiteten til CLas-DETECTR. (A) Agarosegelelektroforese av PCR-resultatene, (B) Ct-verdien av qPCR-resultatene, og (C) CLas-DETECTR-resultatene forsterket med primerparet F-RPA-RNRf og R-RPA-RNRr ved bruk av gDNA ekstrahert fra CLas-positive Newhall-blader og tre andre bakterier. Igjen fungerte H2O som en negativ kontroll. M: DNA-stige; gDNA ekstrahert fra CLas-positive Newhall-blader (1), Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2), Xanthomonas citri subsp . citri (Xcc, 3) og Burkholderia stabilis stamme 1440 isolert i vårt laboratorium (4). Ct-verdien representerer den gjennomsnittlige Ct-verdien på tre tekniske repetisjoner ± standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sensitivitetssammenligning av CLas-DETECTR med PCR og qPCR. Deteksjonsanalyse av en serie spesifikke CLas DNA-amplikonfortynninger ved bruk av (A) PCR, (B) CLas-DETECTR og (C) qPCR. (A) Fra 25 μL av PCR-produktene ble 5 μL lastet inn i gelen. (B) Bildene ble tatt med et smarttelefonkamera gjennom beskyttelsesbriller under lyset som sendes ut av en håndholdt fluorescerende deteksjonsenhet (eksitasjonsbølgelengde: 440 nm, emisjonsbølgelengde: 500 nm). De samme primerne ble brukt i alle analysene. De rensede PCR-produktene med en lengde på 1 060 bp forsterket med primersettet F-RNR og R-RNR rettet mot det CLas-spesifikke nrdB-genet ble fortynnet med H2O i konsentrasjoner på 2,01 × 106 kopier/μL (1), 2,01 × 105 kopier/μL (2), 2,01 × 104 kopier/μL (3), 2,01 × 103 kopier/μL (4), 2,01 × 102 kopier/μL (5), 2,01 × 101 kopier/μL (6), 2,01 × 100 kopier/μL (7) og 2,01 × 10−1 kopier/μL (8). H2O fungerte som en negativ kontroll. M: DNA-stige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: CLas-deteksjon ved hjelp av feltprøver. CLas i 15 bladprøver samlet inn fra Newhall søte appelsintrær ble testet av CLas-DETECTR og qPCR-analyser beskrevet ovenfor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien presenterer en rask og bærbar metode for å oppdage CLas kalt CLas-DETECTR, som kombinerer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemene. Arbeidsflyten er illustrert i figur 1. CLas-DETECTR detekterer CLas med spesifisitet og følsomhet (figur 2 og figur 3). Ved bruk av Newhall-bladprøver detekterer CLas-DETECTR CLas med samme følsomhet som qPCR (figur 4). Spesielt kan deteksjonsresultatene visualiseres direkte gjennom en håndholdt bærbar enhet uavhengig av laboratoriebaserte instrumenter, noe som er kritisk for sanntids HLB-diagnose.
Det er flere viktige hensyn til protokollen. For det første bør krysskontaminering strengt unngås i prøvetakingsprosessen, da CLas-DETECTR er like følsom som qPCR. Reaksjonsreagensene må ikke utsettes for intenst sollys. Alle trinnene må følges nøyaktig for å oppnå optimale resultater. En positiv kontroll, et plasmid som inneholder CLas-spesifikke genfragmenter, bør inkluderes for å sikre at CLas-DETECTR-systemet fungerer riktig i feltet. Til slutt bør alt CLas-relatert eksperimentelt avfall behandles som en biohazard og autoklaveres før deponering.
Hvis det ikke oppdages fluorescenssignaler for den positive kontrollen, kan inhibitorer eksistere i reaksjonsblandingen, og reagensene må endres. Ellers, hvis fluorescensen er for svak til å skille, kan inkubasjonstiden forlenges lengre inkubasjonstid kan føre til falske positiver.
De eksisterende CLas-deteksjonsmetodene krever dyre PCR-maskiner, faste operasjonssteder og opplært personell. Metoden som presenteres her gjør det imidlertid mulig å diagnostisere HLB nøyaktig og følsomt i feltet av et bredt spekter av mennesker, inkludert sitrusdyrkere.
CLas-DETECTR har imidlertid noen begrensninger. For det første kan sitrusprøver ikke brukes direkte i protokollen, og sitrus gDNA må ekstraheres. For det andre er det nødvendig med en enkel inkubator for RPA og aktivering av nukleaseaktiviteten til Cas12a for konsistente resultater. For det tredje må resultatene visualiseres gjennom en håndholdt fluorescerende deteksjonsenhet. Selv om laterale strømningsstrimler kan brukes til å vise resultatene direkte, vil dette øke
Bladprøver ble testet i denne protokollen. I fremtiden kan CLas-DETECTR brukes til å oppdage tilstedeværelsen av CLas i periwinkles- og psyllidprøver. I tillegg, ved å endre crRNA og primere, kan denne molekylære diagnostiske teknologien også brukes til andre sitrus sykdommer, som sitrus canker, sitrus decay virus og sitrus leaf fragmentation virus. Mens vi jobber med CLas-DETECTR, har denne tilnærmingen også blitt brukt til å oppdage CLas parallelt av andre25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av National Key R &D Program of China (2021YFD1400805), Major Science and Technology R &&D-programmet i Jiangxi-provinsen (20194ABC28007), Prosjekter av Jiangxi Education Department (GJJ201449), og Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research i Jiangxi-provinsen (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S.
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
