Summary
הפרוטוקול מציג מודל אימונותרפיה לסרטן באמצעות חיסון מבוסס תאים עם מלנומה B16-F10 המבטאת Flt3L. פרוטוקול זה מדגים את ההליכים, כולל הכנת תאי גידול בתרבית, השתלת גידול, הקרנת תאים, מדידת צמיחת הגידול, בידוד תאי חיסון תוך-גופיים וניתוח ציטומטריה של זרימה.
Abstract
טירוזין קינאז 3 ליגנד דמוי FMS (Flt3L) הוא ציטוקין המטופויאטי המקדם הישרדות והתמיינות של תאים דנדריטיים (DCs). הוא שימש בחיסונים נגד גידולים כדי להפעיל חסינות מולדת ולהגביר את התגובות האנטי-סרטניות. פרוטוקול זה מדגים מודל טיפולי המשתמש בחיסון גידולי מבוסס תאים המורכב מתאי מלנומה B16-F10 המבטאים Flt3L יחד עם ניתוח פנוטיפי ותפקודי של תאי מערכת החיסון במיקרו-סביבה של הגידול (TME). מתוארים נהלים להכנת תאי גידול בתרבית, השתלת גידול, הקרנת תאים, מדידת גודל הגידול, בידוד תאי חיסון תוך-גופיים וניתוח ציטומטריה של זרימה. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק מודל אימונותרפיה פרה-קליני מוצק לגידול, ופלטפורמת מחקר לחקר הקשר בין תאי הגידול לתאי מערכת החיסון החודרים. ניתן לשלב את פרוטוקול האימונותרפיה המתואר כאן עם שיטות טיפוליות אחרות, כגון חסימת מחסום חיסוני (נוגדנים נגד CTLA-4, אנטי-PD-1, אנטי-PD-L1) או כימותרפיה על מנת לשפר את ההשפעה הטיפולית לסרטן של מלנומה.
Introduction
אימונותרפיה של סרטן הוכרה כאסטרטגיה טיפולית מבטיחה המבוססת על תופעות הלוואי הפחות רעילות שלה ותגובות עמידות יותר. פותחו מספר סוגים של אימונותרפיות, כולל טיפולים בנגיף אונקוליטי, חיסונים לסרטן, טיפולי ציטוקינים, נוגדנים חד שבטיים, העברת תאים מאמצים (תאי CAR-T או CAR-NK) וחסימת מחסום חיסוני1.
עבור חיסונים לסרטן, ישנן צורות שונות של חיסונים טיפוליים, כגון חיסונים מבוססי תאים שלמים, חיסונים נגד חלבונים או פפטידים, וחיסוני RNA או DNA. החיסון מסתמך על יכולתם של תאים המציגים אנטיגן (APCs) לעבד אנטיגנים סרטניים, כולל אנטיגנים ספציפיים לגידול, ולהציג אותם בצורה אימונוגנית לתאי T. תאים דנדריטיים (DCs) ידועים כנגמ"שים החזקים ביותר ומאמינים שהם ממלאים תפקיד חשוב בחסינות נגד גידולים 2,3. תאים אלה קולטים ומעבדים אנטיגנים של גידולים, ולאחר מכן נודדים לבלוטות הלימפה המתנקזות (dLN) כדי להתחיל ולהפעיל תאי T אפקטור (Teff) ספציפיים לגידול באמצעות מעורבות של קולטן תאי T (TCR) ומולקולות קוסטימולטוריות. התוצאה היא התמיינות והרחבה של תאי T ציטוטוקסיים ספציפיים לגידול (CTL), אשר חודרים לגידול והורגים תאים סרטניים4. כתוצאה מכך, הפעלה והבשלה של DCs מייצגים אסטרטגיות אטרקטיביות כדי לעורר חסינות נגד אנטיגנים הגידול.
Flt3L ידוע כמקדם הבשלה והרחבה של DCs בוגרים מבחינה תפקודית המבטאים חלבוני MHC Class II, CD11c, DEC205 ו-CD865. מתן תוך-ורידי, אך לא תוך-ורידי, של וקטור אדנו-וירוס המשלב את הגן Flt3L ( Adv-Flt3L ) הוכח כמקדם פעילות טיפולית חיסונית נגד גידולים אורתרוטופיים6. Flt3L שימש גם בחיסונים מבוססי תאי גידול המורכבים מתאי B16-F10 מוקרנים המבטאים ביציבות Flt3L מומרים רטרו-ויראליים כדרך לשפר את ההצגה הצולבת של אנטיגנים סרטניים על ידי DCs, ובכך להגדיל את תגובות האנטי-סרטניות. הפרוטוקול של חיסון גידול B16-Flt3L המתואר כאן מבוסס על מחקר שפורסם על ידי קבוצת7 של ד"ר ג'יימס אליסון. במאמר זה הם דיווחו כי חיסון B16-Flt3L בשילוב עם מצור CTLA-4 גרם באופן סינרגטי לדחייה של מלנומה מבוססת, וכתוצאה מכך להישרדות מוגברת.
מטרת פרוטוקול זה היא לספק מודל אימונותרפי פרה-קליני למלנומה. כאן מתוארים נהלים מפורטים של כיצד להכין ולהשתיל חיסונים לגידולים, וכיצד לנתח את הרכב ותפקוד תאי החיסון התוך-גופיים מגידול מוצק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העכברים ששימשו במחקר נשמרו ושוכנו בוויבריום של מכון לה ג'ולה לאימונולוגיה (LJI) בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים עם טמפרטורה ולחות מבוקרות. ניסויים בבעלי חיים נערכו עם נקבות C57BL/6 עכברות בנות 8-14 שבועות על פי הנחיות ופרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של LJI.
1. הכנת תאי גידול בתרבית להשתלה
- תרבית B16-F10 תאי מלנומה במדיום של דולבקו מעובד (IMDM) של Iscove המכילה 10% FBS מומת בחום, 2 mM גלוטמין, 1 mM נתרן פירובט, 1 mM MEM חומצות אמינו לא חיוניות, ו-100 U/mL כל אחד של פניצילין וסטרפטומיצין. שמור על קו התא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2.
- זרעו 1.5-2 x 106 תאי B16-F10 בבקבוקון 175T ובתרבית למשך יומיים. קציר תאים כאשר הם 75%-80% מפגש.
- הסר את מדיום התרבית ושטוף את הבקבוקון פעם אחת עם PBS. שאפו PBS והוסיפו 5 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ואחריו טפחו בחוזקה על שפת בקבוק התרבות.
- הוסף 15 מ"ל של מדיום תרבות כדי לנטרל את הטריפסין-EDTA ולשפוך את תוכן הבקבוקון לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל. לשטוף את פני השטח עם 10 מ"ל של PBS ויוצקים לתוך אותו צינור 50 מ"ל.
- צנטריפוגה של התאים במשך 5 דקות ב 200 x גרם. השליכו את הסופר-נטנט ושברו את כדור התא על ידי הקשה באצבע על תחתית הצינור.
- הוסף קר 10 מ"ל של PBS בעדינות pipet את ההשעיה התא; לאחר מכן, לספור באופן ידני תאים באמצעות hemocytometer. שמור את התאים על הקרח לפני ההזרקה.
2. השתלת גידולים
- מרדים עכברים בגז עם 5% איזופלוראן בקצב זרימת גז של 1.0 ליטר לדקה במכסה האדים. שנה את קצב הזרימה למינון תחזוקה של 2% איזופלוראן לאחר שהעכברים מורדמים במלואם. עבור פרוטוקול זה, ההרדמה בוצעה על ידי הווטרינר בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
- לגלח את השיער בצד שמאל של העכברים ולעקר את אתר ההזרקה באמצעות מגבונים אלכוהוליים. באופן תוך-עורי (i.d.) משתילים תאי גידול B16-F10 ב-5 x 105 תאים ב-50 μL של PBS קר באגף שמאל באמצעות מחט של 30 גרם.
הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את המינון של תאי גידול B16-F10 מושתלים בטווח של 0.5-5 x 105 תאים להתפתחות מוצלחת של הגידול. - לאחר ההשתלה, יש למדוד את אורך ורוחב הגידול שלוש פעמים בשבוע באמצעות קליפר דיגיטלי אלקטרוני. חשב את נפח הגידול (מ"מ3) באמצעות הנוסחה:
נפח הגידול (מ"מ3) = רוחב2 × אורך × 0.5
לטפל בעכברים עם חיסון הגידול כאשר הגידולים הגיעו לגודל של ≥2 מ"מ.
הערה: גידולים בדרך כלל ניתן למדוד ביום 3 לאחר השתלה של 5 x 10 5תאים סרטניים. קצב גדילה מהיר יותר של גידול B16-F10 נצפה בעכברים זכרים C57BL/6, Rag1-/-, או Rag2-/-γc-/-. תצפית דומה תוארה במחקרים אחרים8. מומלץ לשמור על מין העכברים עקבי. עם זאת, שימו לב שה-NIH שם דגש על מין כמשתנה ביולוגי חשוב במחקר הביו-רפואי.
3. הכנה והזרקה של חיסון של תאי B16-F10 (B16-Flt3L) המבטאים Flt3L
- שמור על תאי B16-Flt3L ב-DMEM המכילים 8% FBS מומת בחום, 2 mM גלוטמין ו-100 U/mL כל אחד של פניצילין וסטרפטומיצין בטמפרטורה של 37°C תחת 5% CO2.
- זרעו 1 x 106 תאי B16-Flt3L בבקבוקון 175T ותרבית למשך יומיים. קציר תאים כאשר הם 75%-80% confluent כמתואר בשלבים 1.3 עד 1.6 ולהשהות 1 מ"ל של PBS קר.
- להקרין תאים במינון של 150 Gy של קרני גמא באמצעות קרינת רנטגן עם הגדרת פרמטרים של 160 kV ו- 25 mA. לספור ולבדוק את כדאיות התא על ידי מכתים כחולים טריפאן לפני ההזרקה.
- גזים מרדימים עכברים כפי שתואר קודם לכן ומעקרים את מקום ההזרקה באמצעות מגבוני אלכוהול. להזריק לעכברים 1 x 10 6 תאי B16-Flt3L מוקרנים ב-50 μL של PBS קר באותו אגף של השתלת הגידול המקורית, ~ 1 ס"מ מאתר הגידול הראשוני בימים 3,6 ו -9 לאחר השתלת התא הראשונית.
- סמן את אתרי הזרקת החיסון בעט צבעוני כדי להבדיל אותו מהגידול הראשוני.
הערה: אם 0.5 x 105 תאי B16-F10 הושתלו לראשונה, מומלץ לבצע טיפול חיסוני בימים 8, 11 ו-14.
4. בידוד תאי חיסון תוך-גופיים
- להקריב עכברים באמצעות CO2 ונקע צוואר הרחם במכסה האדים בסוף הניסוי (ביום 15 לאחר השתלת הגידול; איור 1).
- בניתוח להסיר את הגידול עם העור מכל עכבר ולשים אותו לתוך צלחת 24-well עם 1 מ"ל 10% FBS / RPMI-1640 בינוני. יבשו את הגידולים באמצעות מגבת נייר לפני שקילתה.
- חותכים את הגידולים לחתיכות קטנות. מוסיפים 2 מ"ל של מאגר עיכול (100 מיקרוגרם/מ"ל TL ליבראז ו-200 מיקרוגרם/מ"ל DNase I במדיום RPMI-1640) ודוגרים במשך 25 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
- יש להוסיף 10 מ"ל של 10% FBS/RPMI-1640 בינוני כדי לעצור את העיכול. מעבירים את התאים באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל ומשתמשים בבוכנה של מזרק 1 מ"ל כדי לטחון רקמות על מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
- צנטריפוגה התאים ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יש לתלות את הכדור ב-5 מ"ל של מדיום ספציפי בצפיפות של 40% ב-PBS, מדולל לריכוז של פי 1).
- הוסף את תרחיף התא באיטיות על גבי 5 מ"ל של 80% מדיום ספציפי לשיפוע צפיפות המכיל PBS. צנטריפוגה של התאים בגודל 325 x g עם הגדרת בלמים נמוכה למשך 23 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- לאחר צנטריפוגה, לאסוף בזהירות את שכבת לויקוציטים בממשק בין 40% ל 80% צפיפות ספציפית מדיום ספציפי ולהעביר אותו דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר. צנטריפוגה התאים ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לדגור את הכדור ב 2 מ"ל של תאי דם אדומים (RBC) lysis buffer במשך 5 דקות ב RT. לאחר הדגירה, הוסף 10 מ"ל של 10% FBS / RPMI-1640 בינוני כדי להרוות את מאגר ה- RBC lysis.
- צנטריפוגה התאים ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השהה את התאים במדיום של 0.5 מ"ל של 10% FBS/RPMI-1640 וספור את מספר התאים הכולל לפני השימוש לניתוח נוסף.
הערה: אסוף את הטחול או את ה-dLN כבקרות לאסטרטגיה של תת-קבוצות של תאי מערכת החיסון על-ידי ניתוח ציטומטריה של זרימה. בצע את שיטת בידוד התאים כמתואר לעיל עם השינויים הבאים: השתמש בבוכנה של מזרק 1 מ"ל כדי לטחון רקמות על מסנן רשת 70 מיקרומטר. שטפו את הרקמה עם 10% FBS/RPMI-1640 בינוני כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים. Lyse את RBC כפי שתואר.
5. ניתוח ציטומטריה של זרימה
הערה: תאים שנאספו משכבת הלוקוציטים מכילים תאי חיסון ותאי גידול. מומלץ להשתמש בשני לוחות צביעה עצמאיים.
- צביעת פני השטח
- מעבירים את התאים לצלחת תחתית בצורת V של 96 בארות. שטפו את התאים עם PBS והכתימו אותם בצבע כדאיות התאים (50-100 μL/well) למשך 15 דקות ב-RT.
- צנטריפוגה התאים ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הכתימו את סמני פני השטח בנוגדנים מעורבים (דילול מפורט מסופק בטבלת החומרים) במאגר FACS (1% FBS ו-0.05% NaN3 ב-PBS) למשך 30 דקות על קרח (50-100 μL/ well).
- צנטריפוגה של התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ולשטוף אותם עם חיץ FACS פעמיים.
- תקן את התאים עם מאגר קיבוע תאים (50-100 μL / טוב) במשך 35 דקות על קרח. צנטריפוגה של התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ולשטוף אותם פעמיים עם חיץ FACS.
- אחסן את הדגימות במאגר FACS (150-200 μL/tube) ב-4 °C והגן מפני אור. רכוש את הדגימות על ציטומטר זרימה. עבור אוכלוסיית תאי DCs ותאי T, עקבו אחר אסטרטגיות הגידור המופיעות באיור 2B ובאיור 3A.
הערה: להכתמה של DCs מיאלואידים, מומלץ לדגור על חוסם FC (Rat anti-mouse CD16/CD32) למשך 15 דקות על קרח לפני דגירה של נוגדנים על פני השטח (שלב 5.1.2).
- ניתוח ציטוקינים על גירוי מחדש של ex vivo
- צלחת את התאים במדיום שלם (RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7.2-7.6, 0.1 mM חומצת אמינו לא חיונית, 1 mM נתרן פירובט, 100 U/mL כל פניצילין וסטרפטומיצין, 50 μM 2-mercaptoethanol, ו 2 mM L-גלוטמין) ולעורר עם 50 ng/mL של PMA בתוספת 1 μM ionomycin בנוכחות מעכב הובלת חלבונים במשך 4 שעות ב 37 °C תחת 5% CO2.
- ביצוע צביעת פני השטח עבור סמני פני השטח כמתואר לעיל בשלב 5.1.
- מוסיפים את תמיסת החדירה (50-100 μL/well) ומדגרים במשך 5 דקות ב-RT להכתמה תוך-תאית. דגירה של התאים עם נוגדנים ספציפיים לציטוקינים או חלבונים גרעיניים בתמיסת חלחול (50-100 μL/well) למשך 60 דקות על קרח או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה של התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ולשטוף אותם עם חיץ FACS פעמיים. אחסן את הדוגמאות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והגן מפני אור. רכוש את הדגימות על ציטומטר זרימה.
הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את דילול הנוגדנים לפי הצורך כדי להשיג צביעה מיטבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נקודה שחורה גלויה של תאי B16-F10 המושתלים נצפית בדרך כלל על פני העור ~ 3 ימים לאחר השתלת הגידול. עכברים מטופלים בחיסון הגידול 3, 6 ו -9 ימים לאחר שגולם הגידול הגיע לגודל של ≥2 מ"מ. ראינו ירידה משמעותית בצמיחת הגידול בקבוצת עכברים מחוסנים ~2 שבועות לאחר השתלת הגידול (איור 1). בסוף הניסוי בודדנו את תאי החיסון התוך-גופיים וניתחנו את מספרם ואת ביטוי סמן פני השטח של התא, כמו גם את ייצור הציטוקינים לאחר גירוי קצר במבחנה כמתואר לעיל. תאים שנאספו משכבת לויקוציטים עדיין מכילים תאים סרטניים רבים, מה שמקשה במקצת להגדיר בקלות את אוכלוסיית הלימפוציטים. לכן, מומלץ להשתמש בספלנוציטים מקבילים לצורך גירה נכונה של תת-קבוצות של תאי חיסון תוך-סרטניים בניתוח ציטומטריה של זרימה (איור 2A). כאן מוצגות אסטרטגיות גידור של CD103+CD11c+DC, CD8+, CD4+ ו-Treg (איור 2B ואיור 3A) יחד עם מטריצת הפיצוי (טבלה 1 וטבלה 2). נתונים מייצגים של הספירות הנרכשות והתדירות של כל אוכלוסייה מופיעים גם באיור 2C ובאיור 3B.
CD103+CD11c+DCs תוך-סרטניים, המייצגים את התאים החזקים ביותר לעיבוד אנטיגן של הגידול ולתאים המציגים9,10, מעכברים מחוסנים, הציגו ביטוי מוגבר באופן משמעותי של הליגנד הקוסטימולטורי CD86 (איור 4). עכברים מחוסנים הראו גם עלייה בתאי CD8+ ו-CD4+Foxp3− T החודרים לגידולים (איור 5A), כמו גם ב-CD8+GzmB+ ו-IFN-γ+CTLs (איור 5B). תוצאות אלה מצביעות על כך שחיסון גידול זה מקדם הבשלת DC ומשרה חסינות אנטי-סרטנית חזקה יותר.
איור 1: ניתוח צמיחת הגידול במודל טיפולי של חיסון מבוסס תאים לגידול באמצעות תאי מלנומה B16-F10 המבטאים Flt3L. נקבות C57BL/6 עכברים הושתלו i.d. עם תאי B16-F10 (5 x 105) והוזרקו להם תאי B16-Flt3L מוקרנים (150 Gy) (1 x 106) באתר סמוך באותו אגף. ראשי החץ מציינים את נקודות הזמן של החיסון. מוצגים נתונים מצטברים של ארבעה ניסויים (Control, n = 12; B16-Flt3L, n = 10). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ניתוח סטטיסטי על ידי מדידות חוזרות דו-כיווניות מבחן ANOVA עם Bonferroni לאחר הבדיקה. *P < 0.05; ***P < 0.001. נתון זה שונהמ-11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: אסטרטגיות גטינג של לימפוציטים ו-CD103+CD11c+DCs. (A) אסטרטגיות גידור של לימפוציטים בדגימות טחול וגידול. (B) אסטרטגיות גידור של CD103+CD11c+DCs תוך-סרטניים בדגימת הגידול. (C) מוצגות ספירות ותדירות נרכשות של כל אוכלוסייה מעכבר בקרה מייצג לא מחוסן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: אסטרטגיות גידור של CD8+, CD4+ ו-Treg. (A) אסטרטגיות גידור של תאי T בדגימת גידול. (B) מוצגות ספירות ותדירות נרכשות של כל אוכלוסייה מעכבר בקרה מייצג לא מחוסן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ביטוי פני השטח של CD86 ב-DCs תוך-גופיים מסוג CD103+ . הביטוי מדווח כעוצמת פלואורסצנטיות חציונית (MFI) המנורמלת ל-MFI הממוצע בקבוצת הביקורת (= 1). שליטה, n = 8; B16-Flt3L, n = 10. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ניתוח סטטיסטי על ידי מבחן t של סטודנט לא מזווג. **P < 0.01. נתון זה שונהמ-11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ניתוח של תאי T תוך-סרטניים בעכברים מבוקרים ומחוסנים. (A) ספירה של גידולים החודרים ל-CD8+ (משמאל) ושאינם מסוג Treg CD4+ (מימין) לגרם של רקמת הגידול. (B) ספירה של תאי GzmB+ תוך-סרטניים (משמאל) ו-IFNγ+ (מימין) CD8+ T. שליטה, n = 11; B16-Flt3L, n = 10. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ניתוח סטטיסטי על ידי מבחן t של סטודנט לא מזווג. *P < 0.05; **P < 0.01. נתון זה שונהמ-11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: מטריצת הפיצויים באיור 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: מטריצת הפיצויים באיור 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על המחקר של קבוצתו של אליסון. הם הראו כי שילוב של חיסון B16-Flt3L עם חסימת CTLA-4 הראה השפעה סינרגטית על קצב ההישרדות וצמיחת הגידול, בעוד שלא נצפתה הפחתה בצמיחת הגידול בעכברים שקיבלו את החיסון B16-Flt3L או טיפול בנוגדנים נגד CTLA-4 בלבד7. מחקרים אחרונים חשפו מסלול איתות חדש של Treg-intinsic CTLA4-PKCη הממלא תפקיד חובה חשוב בוויסות הפעילות המדכאת תלוית המגע של Treg11. הן טיפול בחיסון B16-Flt3L לבדו והן שילוב חיסון עם מחיקת PKCη ספציפי לטרג הפחיתו באופן משמעותי את צמיחת הגידול כאשר הושתלו מספר גבוה יותר (0.5-5 x 105) של תאי מלנומה B16-F10 מאשר במחקר של אליסון (1 x 104). הבדלים עדינים במקור של תאי מלנומה או עכברים עשויים להסביר את ההבדל הזה. לכן, מומלץ לטשטש את מספר תאי הגידול המושתלים. חדירה מוגברת של תאי CD8+ T בגידול הראשוני נצפתה באופן דומה במחקר הקודם7. בנוסף, ראינו ביטוי מוגבר של CD86 ב-CD103+CD11c+DCs תוך-סרטניים, מה שככל הנראה מסביר הפעלה והרחבה חזקות יותר של CTLs מסוג CD8+ המסתננים לגידולים.
פרוטוקול זה, המשתמש בחיסון גידולי מבוסס תאים המבטא Flt3L, נוח ופשוט לשימוש, ומשמש כמודל אמין לחקר חדירות תאי חיסון תוך-גופיים, כולל DCs. לדוגמה, איתות PKCη נדרש עבור פעילות מדכאת תלוית מגע של Treg. לפיכך, Prkch−/− Treg הציג יעילות הצמדה גבוהה יותר עם נגמ"שים במערכת גידול של Treg -DC במבחנה, מה שמצביע על פגם ביכולת של Prkch−/− Treg לשבור מגע ולהתנתק מ- DCs12 המחוברים. חיסון B16-Flt3L ככל הנראה מגייס DCs בוגרים יותר המציגים אנטיגנים ספציפיים לגידול בצורה יעילה יותר, ולכן סביר להניח שהוא יקל על התצפית על האינטראקציה בין Treg החודר לגידול לבין DC על ידי הדמיית תאים חיים.
שמירה על מרחק מספיק בין הגידול הראשוני לחיסון הגידול היא תכונה חשובה בפרוטוקול זה. הפרדה פיזית זו היא קריטית על מנת לאפשר מקום לצמיחת הגידול הראשוני ולמנוע איחוי פוטנציאלי בין שני השתלים הגידוליים. לחלופין, ניתן להשתיל את החיסון נגד הגידול באגף הנגדי ביחס לגידול הראשוני, שכן דווח גם כי הדבר מעכב את צמיחת הגידול7. מגבלה אחת של המחקר היא היעדר מקור מסחרי של קו תאים B16-Flt3L, אך ניתן ליישם את אותו רעיון על סוגי גידולים אחרים, למשל, אדנוקרצינומות ערמונית TRAMP-C27.
למרות שהפרוטוקול המתואר כאן משתמש בתאי מלנומה B16-F10 כמודל גידולי, ניתן להתאים ולשנות את העקרונות הבסיסיים לפי הצורך כדי לבסס מודלים אימונותרפיים לגידולים מוצקים אחרים. יתר על כן, ניתן לשלב בקלות את פרוטוקול החיסון שבו השתמשנו עם שיטות טיפוליות אחרות, למשל, חסימת מחסום מבוססת CTLA-4 או PD-1, על מנת להשיג השפעות נוספות או סינרגטיות שעלולות לגרום לחסינות אנטי-סרטנית חזקה יותר ולהישרדות מוגברת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר סטיבן שנברגר על אספקת תאי B16-Flt3L ולצוות של מתקני הציטומטריה של בעלי חיים וזרימה LJI לתמיכה מצוינת.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
DNase I | Sigma | 11284932001 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
PMA | Sigma | P1585 | |
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
TL Liberase | Roche | 477530 | |
Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
Antibodies | |||
Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Banchereau, J., et al.
Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000). - Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280 (2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).
- Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).
- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).