Caenorhabditis elegans의 수명 및 유전자 전사 분석을위한 지질 보충
Summary
본 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에 대한 액체 및 온플레이트 배양에서 지질 보충 방법을 설명하고 벌크 또는 소수의 웜 및 웜 조직으로부터의 종단 연구 및 유전자 전사 분석과 결합합니다.
Abstract
노화는 환경 적 및 유전 적 기여로 인한 점진적인 생리적 변화를 특징으로하는 복잡한 과정입니다. 지질은 세포막의 구조적 구성 요소를 구성하고 에너지를 저장하며 신호 분자로 사용하는 데 중요합니다. 지질 대사 및 신호 전달의 조절은 뚜렷한 장수 경로를 활성화하는 데 필수적입니다. 회충 Caenorhabditis elegans 는 지질 대사의 기여와 장수 조절의 신호 전달을 해부하는 우수하고 강력한 유기체입니다. 여러 연구 연구에서 특정 지질 분자의 식단 보충제가 C. elegans 수명을 연장하는 방법을 설명했습니다. 그러나 보충 조건의 사소한 차이로 인해 다른 실험실의 과학자들 사이에서 재현성 문제가 발생할 수 있습니다. 여기에서 C. elegans 에 대한 두 가지 자세한 보충 방법은 접시에 파종 된 박테리아 또는 액체 배양에서 박테리아 현탁액으로 지질 보충을 사용하는 것으로보고되었습니다. 또한 본원에는 몇 가지 웜으로부터 유래된 전체 웜 용해물 또는 해부된 조직을 사용하여 평생 지질 보충 및 qRT-PCR 분석을 통한 수명 분석을 수행하기 위한 세부 정보가 제공된다. 지질 보충에 대한 종단 연구와 전사 조사의 조합을 사용하여 수유 분석은 지질이 수명과 건강한 노화에 어떻게 영향을 미치는지 해부하는 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다. 이 방법론은 또한 소수의 해부 조직 또는 소수의 동물을 사용하여 전사체의 하위 집합의 변화를 평가하기 위해 다양한 영양 스크리닝 접근법에 적용될 수 있습니다.
Introduction
지질
지질은 유기 용매에 용해되지만 물 1,2에는 녹지 않는 작은 소수성 또는 양친매성 분자입니다. 별개의 지질 분자는 사슬에 포함 된 탄소의 수, 위치, 이중 결합 수 및 글리세롤 또는 인산염을 포함한 결합 구조에 따라 서로 구별됩니다. 지질은 막 이중층을 구성하고, 에너지 저장을 제공하고, 신호 분자 3,4로 작용하는 것을 포함하여 유기체 기능을 조절하기 위해 별개의 세포 내에서 그리고 별개의 세포에 걸쳐 중요한 역할을 합니다.
첫째, 지질은 세포외 환경에서 내부 구획을 분할하는 원형질막과 세포내 세포하막을 포함하는 생물학적 막의 구조적 구성 요소입니다. 둘째, 지질은 척추 동물과 무척추 동물의 주요 에너지 저장 형태입니다. 트리 아실 글리세롤을 포함한 중성 지질은 지방 조직을 포함한 다양한 조직에 장기간 저장됩니다. 선충류에서 Caenorhabditis elegans, 장은 주요 대사성 지방 저장 기관입니다. 그 기능은 영양소의 소화 및 흡수뿐만 아니라 포유류 간세포의 활동과 유사한 해독 과정에도 관여합니다. 다른 지방 저장 조직으로는 지질이 난 모세포 발달에 필수적인 생식선과 피부와 같은 표피 세포 3,5로 구성된 피하가 있습니다. 셋째, 최근 몇 년 동안 지질은 G 단백질 결합 및 핵 수용체를 포함한 다양한 수용체에 직접 작용하거나 막 유동성 조절 또는 번역 후 변형을 통해 간접적으로 작용하여 세포 내 및 세포 외 신호 전달에 관여하는 강력한 신호 전달 분자라는 더 많은 증거가 있습니다 6,7,8,9 . 추가 연구는 장수와 건강 수명을 촉진하는 지질 신호 전달의 기본 분자 메커니즘을 계속 밝힐 것입니다.
모델 유기체는 인간에서 연구하기에는 너무 복잡한 특정 생물학적 질문을 해결하는 데 중요합니다. 예를 들어, 회충 C. elegans는 인간의 영양 및 질병10과 관련된 생물학적 과정을 해부하기 위해 유전자 분석을 수행하기위한 훌륭한 모델입니다. 인간 생리학, 복잡한 조직, 행동 패턴 및 풍부한 유전자 조작 도구와 관련된 고도로 보존 된 분자 경로는 C. elegans를 주목할만한 모델 유기체로 만듭니다11. 예를 들어, C. elegans는 표현형 특이적 유전자를 식별하기 위한 유전자 스크리닝뿐만 아니라 RNA 간섭12를 통한 게놈 전체의 역 유전자 스크리닝을 전달하는 데 탁월합니다.
실험실에서 선충류는 대장균 박테리아의 잔디밭이 뿌려진 한천 페트리 플레이트에서 재배되어 단백질, 탄수화물, 포화 및 불포화 지방산과 같은 다량 영양소를 에너지 및 빌딩 블록의 원천으로 제공하고 보조 인자 및 비타민13과 같은 미량 영양소를 제공합니다. 포유류와 유사하게 선충류는 팔 미트 산과 스테아르 산 (각각 포화 16- 탄소 및 18- 탄소 분자)에서 지방산 분자를 합성하여 순차적으로 불포화되고 다양한 단일 불포화 지방산 (MUFA) 및 폴리 불포화 지방산 (PUFA)14,15,16,17,18. 흥미롭게도 C. elegans는 지방산 생합성, 불포화 및 신장에 관여하는 모든 필수 지방산 및 핵심 효소의 de novo 합성이 가능하여 장쇄 PUFA의 합성을 촉진합니다19. 다른 동물 종과 달리 C. elegans는 자체 ω-3 불포화 효소를 사용하여 18- 탄소 및 20- 탄소 ω-6 지방산을 ω-3 지방산으로 전환 할 수 있습니다. 또한 웜은 올레산 (OA, 18 : 1)20,21에서 리놀레산 (LA)의 형성을 촉매하는 Δ12 불포화 효소를 가지고 있습니다. 대부분의 동물이나 식물은 Δ12 및 ω-3 불포화 효소가 모두 부족하므로 PUFA를 얻기 위해 ω-6 및 ω-3의식이 섭취에 의존하는 반면 C. elegans는식이 지방산을 필요로하지 않습니다22. 기능적 불포화효소 효소가 결여된 분리된 돌연변이체는 생식, 성장, 수명 및 신경전달을 포함한 별개의 생물학적 과정에서 특정 지방산의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 특정 생물학적 경로에 대한 개별 지방산의 영향은 유전적 접근과 식이 보충제16,17,23을 모두 사용하여 해결할 수 있습니다. 현재까지 지질 연구는 신경 학적 및 발달 적 조건에서 지질 합성, 분해, 저장 및 분해에 관여하는 유전자를 특성화하는 데 중점을 두었습니다24. 그러나 장수 조절에서 지질의 역할은 이제 막 밝혀지기 시작했습니다.
수명 조절의 지질 신호 전달
지질은 별개의 조직과 세포 유형에서 세포 신호 전달 캐스케이드를 활성화하여 수명 조절에 중요한 역할을 합니다. 최근 연구는 지질 결합 단백질 또는 막 수용체25의 인식을 통한 전사 및 세포-세포 통신을 조절하는 지질의 적극적인 역할을 강조했습니다. 또한식이 지질 보충제는 지질 대사가 C. elegans의 수명에 어떻게 영향을 미치는지 해부하는 훌륭한 도구를 제공합니다. 뚜렷한 MUFA와 PUFA는 전사 인자26,27을 활성화하여 수명을 촉진하는 것으로 나타났습니다.
인슐린 / IGF-1 신호 전달 및 생식선 전구체 세포의 절제를 포함한 장수 모델은 MUFA 생합성 경로와 관련이 있으며 올레산, 팔미 톨레산 및 시스-백시닉을 포함한 MUFA 보충제는 C. elegans 수명을 연장하기에 충분합니다26. MUFA 행정부가 부여한 장수 효과는 추가 조사가 필요하지만 기본 메커니즘은 산화 스트레스 반응 및 수명 조절28,29의 핵심 활성화제인 SKN-1/Nrf2 전사 인자에 의해 매개될 가능성이 높습니다. MUFA 중에서 N- 아실 에탄올 아민 (NAEs)이라고하는 특정 종류의 지방 아실 에탄올 아미드는 염증, 알레르기, 학습, 기억 및 에너지 대사를 포함한 별개의 메커니즘에서 중요한 역할을합니다30. 특히, 올레 오일 에탄올 아미드 (OEA)로 알려진 지질 분자는 지질 결합 단백질 8 (LBP-8)의 핵으로의 전좌를 촉진하여 핵 호르몬 수용체 NHR-49 및 NHR-807. OEA 아날로그 KDS-5104의 보충은 수명을 연장하기에 충분하며 산화 스트레스 반응 및 미토콘드리아 β 산화 7,8에 관여하는 유전자의 발현을 유도합니다.
동시에 PUFA의 역할은 장수 규제와도 관련이 있습니다. PUFA ω-3 지방산 α- 리놀렌산 (ALA)의 투여는 NHR-49 / PPARα, SKN-1 / NRF 전사 인자를 활성화하고 미토콘드리아 β 산화31을 유도하여 장수를 촉진합니다. 흥미롭게도, 옥시리핀으로 지칭되는 ALA의 과산화 생성물은 SKN-1/NRF를 활성화시켜 PUFA와 그 산화 유도체 모두가 장수 이점을 부여할 수 있음을 시사한다23. ω-6 지방산 아라키돈산(AA)과 디호모-γ-리놀렌산(DGLA)의 보충은 자가포식 활성화를 통해 수명을 연장하고 단백질 품질 관리를 촉진하며 낭비되고 독성이 있는 단백질 응집체27,32의 분해를 초래합니다. 보다 최근에, 지질 결합 단백질 3 (LBP-3) 및 DGLA에 의해 매개되는 세포 – 비 자율 신호 조절은 말초 신호를 뉴런에 보내 수명을 촉진하는 데 중요한 것으로 나타 났으며, 이는 전신 수준에서 조직 간 통신에서 지질 분자의 장거리 역할을 시사한다33. 본 연구는 액체 배양에서 플레이트에 파종된 박테리아 또는 박테리아 현탁액으로 지질 보충을 수행하는 각 단계를 보고합니다. 이러한 방법론은 전신 내용 또는 몇 가지 벌레에서 파생된 해부 조직을 사용하여 수명 및 전사 분석을 평가하는 데 사용됩니다. 다음 기술은 다양한 영양 연구에 적용될 수 있으며 지질 대사가 수명과 건강한 노화에 어떻게 영향을 미치는지 해부하는 유효한 도구를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지질 보충제는 건강한 노화에 대한 특정 지질 종의 직접적인 영향을 설명하기 위해 노화 연구에 사용되었습니다 6,7,23,26,27,31. 그러나 지질 보충 절차는 어려울 수 있으며 실험 간의 불일치로 인해 재현 불가능한 결과가 발생할 수 있습니다. 여기에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
유지 보수 지원에 대해 P. Svay에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), 마치 오브 다임스 재단 (MCW), 웰치 재단 (MCW), HHMI 조사관 (MCW) 및 NIH T32 ES027801 박사 전 학생 펠로우 (MS). 일부 균주는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)가 자금을 지원하는 CGC에서 제공했습니다.
Materials
| 1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
| Agarose | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
| Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
| Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
| Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
| Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
| Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
| Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
| Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
| TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
| Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
| VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
| Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
References
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