Den nåværende protokollen beskriver lipidtilskuddsmetoder i flytende og on-plate kulturer for Caenorhabditis elegans, kombinert med longitudinelle studier og gentranskripsjonsanalyse fra bulk eller noen få ormer og ormvev.
Aldring er en kompleks prosess preget av progressive fysiologiske endringer som følge av både miljømessige og genetiske bidrag. Lipider er avgjørende for å utgjøre strukturelle komponenter i cellemembraner, lagre energi og som signalmolekyler. Regulering av lipidmetabolisme og signalering er viktig for å aktivere forskjellige levetidsveier. Rundorm Caenorhabditis elegans er en utmerket og kraftig organisme for å dissekere bidraget av lipidmetabolisme og signalering i levetidsregulering. Flere forskningsstudier har beskrevet hvordan dietttilskudd av spesifikke lipidmolekyler kan forlenge C. elegans levetid; Imidlertid kan mindre forskjeller i tilskuddsbetingelsene forårsake reproduserbarhetsproblemer blant forskere i forskjellige laboratorier. Her rapporteres to detaljerte tilskuddsmetoder for C. elegans ved bruk av lipidtilskudd enten med bakterier frøet på plater eller bakteriell suspensjon i flytende kultur. Også gitt her er detaljene for å utføre levetidsanalyser med livslang lipidtilskudd og qRT-PCR-analyse ved hjelp av et helt ormlysat eller dissekert vev avledet fra noen få ormer. Ved hjelp av en kombinasjon av longitudinelle studier og transkripsjonsundersøkelser ved lipidtilskudd, gir fôringsanalysene pålitelige tilnærminger for å dissekere hvordan lipider påvirker levetid og sunn aldring. Denne metoden kan også tilpasses ulike ernæringsmessige screeningtilnærminger for å vurdere endringer i en delmengde av transkripsjoner ved hjelp av enten et lite antall dissekerte vev eller noen få dyr.
Lipider
Lipider er små hydrofobe eller amfipatiske molekyler som er oppløselige i organiske løsningsmidler, men uoppløselige i vann 1,2. Distinkte lipidmolekyler skiller seg fra hverandre basert på antall karboner inneholdt i deres kjeder, plassering, antall dobbeltbindinger og bundne strukturer, inkludert glyserol eller fosfater. Lipider spiller avgjørende roller i og på tvers av forskjellige celler for å regulere organismefunksjoner, inkludert konstituering av membran dobbeltlag, gir energilagring og fungerer som signalmolekyler 3,4.
For det første er lipider strukturelle komponenter av biologiske membraner, inkludert plasmamembranen og intracellulære subcellulære membraner som deler de indre rommene fra det ekstracellulære miljøet. For det andre er lipider den viktigste formen for energilagring hos virveldyr og virvelløse dyr. Nøytrale lipider, inkludert triacylglyceroler, lagres i lengre tid i forskjellige vev, inkludert i fettvev. I nematoden Caenorhabditis elegans er tarmen det viktigste metabolske fettlagringsorganet; Dens funksjon er ikke bare involvert i fordøyelse og absorpsjon av næringsstoffer, men også i avgiftningsprosessen, som ligner aktiviteten til pattedyrs hepatocytter. Andre fettlagringsvev inkluderer kimlinjen, der lipider er essensielle for å utvikle oocytter, og hypodermis, som består av hudlignende epidermale celler 3,5. For det tredje har flere bevis de siste årene antydet at lipider er kraftige signalmolekyler involvert i intra- og ekstracellulær signalering ved å virke direkte på en rekke reseptorer, inkludert G-proteinkoblede og nukleære reseptorer, eller indirekte via membranfluiditetsmodulasjon eller posttranslasjonelle modifikasjoner 6,7,8,9 . Videre studier vil fortsette å belyse de underliggende molekylære mekanismene for lipidsignalering for å fremme lang levetid og helsespan.
Modellorganismer er viktige for å løse spesifikke biologiske spørsmål som er for komplekse til å studere hos mennesker. For eksempel er rundorm C. elegans en utmerket modell for å gjennomføre genetisk analyse for å dissekere biologiske prosesser som er relevante for menneskelig ernæring og sykdom10. De svært konserverte molekylære veiene som er relevante for menneskelig fysiologi, komplekse vev, atferdsmønstre og rikelig genetiske manipulasjonsverktøy gjør C. elegans til en bemerkelsesverdig modellorganisme11. For eksempel er C. elegans utmerket i å videresende genetiske skjermer for å identifisere fenotypespesifikke gener, så vel som i genom-brede omvendte genetiske skjermer via RNA-interferens12.
I laboratorier dyrkes nematodene på agar petriplater frøet med en plen av Escherichia coli-bakterier, som gir makronæringsstoffer som proteiner, karbohydrater og mettede og umettede fettsyrer som energikilder og byggesteiner, og mikronæringsstoffer som kofaktorer og vitaminer13. I likhet med pattedyr syntetiserer nematoder fettsyremolekyler fra både palmitinsyre og stearinsyre (henholdsvis mettet 16-karbon og 18-karbonmolekyler) som er sekvensielt desaturert og langstrakt til en rekke mono-umettede fettsyrer (MUFA) og poly-umettede fettsyrer (PUFA) 14,15,16,17,18. Interessant nok er C. elegans i stand til de novo syntese av alle nødvendige fettsyrer og kjerneenzymer involvert i fettsyrebiosyntese, desaturasjon og forlengelse, noe som letter syntesen av langkjedede PUFA19. Forskjellig fra andre dyrearter, kan C. elegans konvertere 18-karbon og 20-karbon ω-6 fettsyrer til ω-3 fettsyrer med egne ω-3 desaturase enzymer. I tillegg har ormer en Δ12 desaturase som katalyserer dannelsen av linolsyre (LA) fra oljesyre (OA, 18: 1) 20,21. De fleste dyr eller planter mangler både Δ12 og ω-3 desaturaser og er dermed avhengige av diettinntak på ω-6 og ω-3 for å få sine PUFAer, mens C. elegans ikke krever diettfettsyrer22. Isolerte mutanter som mangler funksjonelle desaturase enzymer har blitt brukt til å studere funksjonene til spesifikke fettsyrer i forskjellige biologiske prosesser, inkludert reproduksjon, vekst, lang levetid og nevrotransmisjon. Effekten av individuelle fettsyrer på spesifikke biologiske veier kan løses ved hjelp av både en genetisk tilnærming og dietttilskudd16,17,23. Hittil har lipidforskning fokusert på å karakterisere gener involvert i lipidsyntese, nedbrytning, lagring og nedbrytning i nevrologiske og utviklingsmessige forhold24. Imidlertid begynner lipidens roller i levetidsregulering bare å bli avslørt.
Lipidsignalering i levetidsregulering
Lipider spiller avgjørende roller i levetidsregulering ved å aktivere cellulære signalkaskader i forskjellige vev og celletyper. Nylige studier har fremhevet lipidens aktive roller i modulering av transkripsjon og cellecellekommunikasjon via lipidbindende proteiner eller anerkjennelse av membranreseptorer25. I tillegg tilbyr kosttilskudd lipidtilskudd et utmerket verktøy for å dissekere hvordan lipidmetabolismen påvirker levetiden i C. elegans. Distinkte MUFAer og PUFAer har vist seg å fremme lang levetid ved å aktivere transkripsjonsfaktorer26,27.
Levetidsmodeller, inkludert insulin / IGF-1-signalering og ablasjon av kimlinjeforløperceller, er assosiert med MUFA-biosynteseveien, og MUFA-tilskudd, inkludert oljesyre, palmitolsyre og cis-vaccenic, er tilstrekkelig til å forlenge C. elegans levetid26. Selv om levetidseffekten gitt av MUFA-administrasjonen krever ytterligere undersøkelser, vil den underliggende mekanismen sannsynligvis bli formidlet av SKN-1/Nrf2-transkripsjonsfaktoren, som er en nøkkelaktivator for oksidativ stressrespons og levetidsregulering28,29. Blant MUFA spiller en bestemt klasse av fete acyletanolamider kalt N-acyletanolaminer (NAE) avgjørende roller i forskjellige mekanismer, inkludert betennelse, allergier, læring, minne og energimetabolisme30. Spesielt har lipidmolekylet kjent som oleoyletanolamid (OEA) blitt identifisert som en positiv regulator av lang levetid ved å fremme translokasjonen av det lipidbindende proteinet 8 (LBP-8) inn i kjernen for å aktivere nukleære hormonreseptorer NHR-49 og NHR-807. Tilskudd av OEA-analogen KDS-5104 er tilstrekkelig til å forlenge levetiden, og induserer uttrykket av gener involvert i oksidative stressresponser og mitokondriell β-oksidasjon 7,8.
Samtidig har PUFA-rollen også vært knyttet til levetidsregulering. Administrering av PUFA ω-3 fettsyre α-linolensyre (ALA) fremmer lang levetid ved å aktivere transkripsjonsfaktorene NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF og indusere mitokondriell β-oksidasjon31. Interessant nok aktiverer peroksiderte produkter av ALA, referert til som oksylipiner, SKN-1 / NRF, noe som tyder på at både PUFA og deres oksidative derivater kan gi levetidsfordeler23. Tilskudd av ω-6 fettsyre arakidonsyre (AA) og dihomo-γ-linolensyre (DGLA) forlenger levetiden via autofagiaktivering, fremmer proteinkvalitetskontroll og resulterer i nedbrytning av bortkastede og giftige proteinaggregater27,32. Mer nylig har en celle-ikke-autonom signalregulering mediert av lipidbindende protein 3 (LBP-3) og DGLA vist seg å være avgjørende for å fremme lang levetid ved å sende perifere signaler til nevroner, noe som tyder på en langdistanserolle av lipidmolekyler i kommunikasjon mellom vev på systemiske nivåer33. Den foreliggende studien rapporterer hvert trinn for å utføre lipidtilskudd med bakterier frøet på plater eller bakteriell suspensjon i flytende kultur. Disse metodene brukes til å vurdere levetid og transkripsjonsanalyse, ved hjelp av helkroppsinnhold eller dissekert vev avledet fra noen få ormer. Følgende teknikker kan tilpasses en rekke ernæringsstudier og tilbyr et gyldig verktøy for å dissekere hvordan lipidmetabolismen påvirker lang levetid og sunn aldring.
Lipidtilskudd har blitt brukt i aldringsforskning for å belyse den direkte effekten av visse lipidarter på sunn aldring 6,7,23,26,27,31. Imidlertid kan lipidtilskuddsprosedyren være utfordrende, og enhver inkonsekvens mellom eksperimenter kan forårsake ikke-reproduserbare resultater. Her er den første detaljerte trinnvis…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker P. Svay for vedlikeholdsstøtte. Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (M.C.W.) og NIH T32 ES027801 pre-doctoral student fellow (MS). Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
Agarose | Sigma | A9639-500G | |
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
Worm picker | WormStuff | 59-AWP |