Utveckling av knock-out muskelcellinjer med Lentivirusmedierad CRISPR / Cas9-genredigering

Summary

Protokollet beskriver hur man genererar knock-out myoblaster med CRISPR / Cas9, från utformningen av guide-RNA till cellulär kloning och karakterisering av knock-out-klonerna.

Abstract

En viktig tillämpning av clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 är utvecklingen av knock-out cellinjer, specifikt för att studera funktionen hos nya gener/proteiner associerade med en sjukdom, identifierade under den genetiska diagnosen. För utvecklingen av sådana cellinjer måste två huvudfrågor lösas upp: införande av CRISPR-verktygen (Cas9 och guide-RNA) med hög effektivitet i de valda cellerna och begränsning av Cas9-aktiviteten till den specifika raderingen av den valda genen. Protokollet som beskrivs här är dedikerat till införandet av CRISPR-verktygen i svårtransfekterade celler, såsom muskelceller. Detta protokoll är baserat på användningen av lentivirus, framställda med plasmider allmänt tillgängliga, för vilka alla kloningssteg beskrivs för att rikta in sig på en gen av intresse. Kontrollen av Cas9-aktivitet har utförts med hjälp av en anpassning av ett tidigare beskrivet system som kallas KamiCas9, där transduktionen av cellerna med ett lentivirus som kodar för ett guide-RNA riktat mot Cas9 möjliggör gradvis avskaffande av Cas9-uttryck. Detta protokoll har tillämpats på utvecklingen av en RYR1-knock out human muskelcelllinje, som har karakteriserats ytterligare på protein- och funktionsnivå, för att bekräfta knockouten av denna viktiga kalciumkanal som är involverad i muskel intracellulär kalciumfrisättning och i excitation-kontraktionskoppling. Förfarandet som beskrivs här kan enkelt tillämpas på andra gener i muskelceller eller i andra svårtransfekterade celler och producera värdefulla verktyg för att studera dessa gener i mänskliga celler.

Introduction

Med utvecklingen av gensekvensering och identifiering av mutationer i gener med okända funktioner i en specifik vävnad utgör utvecklingen av relevanta cellulära modeller för att förstå funktionen hos en ny målgen och bekräfta dess engagemang i de relaterade patofysiologiska mekanismerna ett viktigt verktyg. Dessutom är dessa modeller av stor betydelse för den framtida terapeutiska utvecklingen ^1,2 och utgör ett intressant alternativ till utvecklingen av knock-out djurmodeller i rak linje med de internationella rekommendationerna för minskad användning av djur i försök. Genredigering med CRISPR/Cas9 är bland de mest kraftfulla verktygen som för närvarande finns tillgängliga, vilket har möjliggjort utvecklingen av många knock-out/knock-in-modeller, och riktad genvalidering med CRISPR/Cas9 är bland de mest använda applikationerna av CRISPR/Cas9³. Framgången för genredigering är beroende av förmågan att introducera CRISPR-verktygen (guiden RNA och nukleas cas9) i målcellsmodellen, vilket kan vara en utmaning i många svårtransfekterade celler, såsom muskelceller⁴. Denna utmaning kan övervinnas med användning av virus, vanligtvis lentivirus, som har den stora fördelen att effektivt transducera många celltyper och leverera sin transgen. Men dess största nackdel är integrationen av transgenen i värdcellgenomet, vilket leder till potentiell förändring av gener lokaliserade på integrationsstället och till det permanenta uttrycket av transgenen, vilket i fallet med nukleas cas9 skulle resultera i skadliga konsekvenser⁵. En smart lösning har föreslagits av Merienne och^{kollegorna 6}, som består av introduktion i cellerna av ett guide-RNA riktat mot själva Cas9-genen, vilket leder till Cas9-inaktivering. En anpassning av denna strategi presenteras här som ett användarvänligt och mångsidigt protokoll som gör det möjligt att slå ut praktiskt taget vilken gen som helst i svårtransfekterade celler.

Målet med protokollet som presenteras här är att inducera inaktiveringen av en gen av intresse för odödliga muskelceller. Det kan användas för att slå ut alla gener av intresse, i olika typer av odödliga celler. Protokollet som beskrivs här innehåller steg för att designa guiden RNA och deras kloning till lentivirala plasmider, för att producera CRISPR-verktygen i lentivirala vektorer, för att transducera cellerna med de olika lentivirusen och för att klona cellerna för att producera en homogen redigerad cellinje.

Med hjälp av detta protokoll har odödliga mänskliga skelettmuskelceller utvecklats med radering av typ 1 ryanodinreceptorn (RyR1), en viktig kalciumkanal som är involverad i intracellulär kalciumfrisättning och muskelkontraktion⁷. Knock-out (KO) av genen har bekräftats på proteinnivå med western blot och på funktionsnivå med kalciumavbildning.

Protocol

Muskelbiopsier erhölls från Bank of Tissues for Research (Myobank, en partner i EU-nätverket EuroBioBank, Paris, Frankrike) i enlighet med europeiska rekommendationer och fransk lagstiftning. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla individer. Odödliga myoblaster producerades vänligt av Dr. V. Mouly (Myology Institute, Paris, Frankrike), och protokollen godkändes av Myology Institute etikkommitté (MESRI, n AC-2019-3502). 1. CRISPR-guide design Identi…

Representative Results

Detta protokoll tillämpades på odödliga myoblaster från ett friskt ämne15 (så kallade HM-celler, för humana myoblaster), där RyR1 tidigare har karakteriserats16, för att slå ut RYR1-genen som kodar för RyR1-proteinet. Utformningen av guiderna RNA gjordes för att radera sekvensen som omfattar en del av exon 101 och intron 101 av genen. Radering av en del av exon 101 förutses leda till störningar i läsramen. Dessutom kodar exon 101 för proteinets por …

Discussion

Ett viktigt steg på vägen mot karakterisering av gener med okänd funktion som är involverade i patologier är utvecklingen av relevanta cellulära modeller för att studera funktionen hos dessa gener. Användningen av genredigering med CRISPR/Cas9 är ett exponentiellt växande forskningsfält, och utvecklingen av knock-out-modeller som presenteras här är bland de mest använda applikationerna. I detta sammanhang föreslår vi här ett mångsidigt protokoll för att utveckla en mänsklig cellinje knock-out i vilken…

Materials

Anti-CACNA1S antibody	Sigma-Aldrich	HPA048892	Primary antibody
Blp I	NE BioLabs	R0585S	Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit	Takara	631312	Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG	GeneTex	GTX221667-01	HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG	GeneTex	GTX221666	HRP secondary antibody
Fluo-4 direct	Molecular Probes	F10472	Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#2118	Primary antibody
HindIII	Fermentas	ER0501	Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus	Takara	638920	Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC	ThermoFisher Scientific	F532L	Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody	DHSB	MF20	Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	REF 740424	Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609	DNA purification
NucleoSpin Tissue	Macherey-Nagel	740952	Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli	ThermoFisher Scientific	C737303	Chemically competent cells
Plasmid #87904	Addgene	87904	Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919	Addgene	87919	Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260	Addgene	12260	Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454	Addgene	8454	Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody	Invitrogene	R96025	Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	Chemically competent cells
Xma I	NE BioLabs	R0180S	Restriction enzyme