Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Разработка нокаутирующих мышечных клеточных линий с использованием лентивирусно-опосредованного редактирования генов CRISPR/Cas9

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1University Grenoble Alpes, INSERM, U1216, CHU Grenoble Alpes, Grenoble Institut Neurosciences, 2Genome Center, University of California, Davis

Summary

Протокол описывает, как генерировать нокаутирующие миобласты с помощью CRISPR/Cas9, начиная от проектирования направляющих РНК до клеточного клонирования и характеристики нокаутирующих клонов.

Abstract

Одним из важных применений кластерных регуляторных межпространственных коротких палиндромных повторов (CRISPR)/Cas 9 является разработка нокаутирующих клеточных линий, в частности, для изучения функции новых генов/белков, связанных с заболеванием, выявленных в ходе генетической диагностики. Для развития таких клеточных линий необходимо распутать две основные проблемы: вставка инструментов CRISPR (Cas9 и направляющая РНК) с высокой эффективностью в выбранные клетки и ограничение активности Cas9 специфической делецией выбранного гена. Протокол, описанный здесь, посвящен вставке инструментов CRISPR в трудно трансфектируемые клетки, такие как мышечные клетки. Этот протокол основан на использовании лентивирусов, продуцируемых с плазмидами, общедоступными, для которых все этапы клонирования описаны для нацеливания на интересующий ген. Контроль активности Cas9 был выполнен с использованием адаптации ранее описанной системы под названием KamiCas9, в которой трансдукция клеток лентивирусом, кодирующим направляющую РНК, нацеленную на Cas9, позволяет прогрессировать отмену экспрессии Cas9. Этот протокол был применен к разработке RYR1-нокаутирующей линии мышечных клеток человека, которая была дополнительно охарактеризована на белковом и функциональном уровне, чтобы подтвердить нокаут этого важного кальциевого канала, участвующего в внутриклеточном высвобождении кальция мышц и в связи возбуждение-сокращение. Процедура, описанная здесь, может быть легко применена к другим генам в мышечных клетках или в других трудно трансфектируемых клетках и производить ценные инструменты для изучения этих генов в клетках человека.

Introduction

С прогрессом секвенирования генов и идентификацией мутаций в генах неизвестных функций в конкретной ткани разработка соответствующих клеточных моделей для понимания функции нового гена-мишени и подтверждения его участия в связанных патофизиологических механизмах представляет собой важный инструмент. Кроме того, эти модели имеют большое значение для будущих терапевтических разработок 1,2 и представляют собой интересную альтернативу разработке нокаутированных моделей животных в прямой линии с международными рекомендациями по сокращению использования животных в экспериментах. Редактирование генов с использованием CRISPR / Cas9 является одним из самых мощных инструментов, доступных в настоящее время, что позволило разработать множество нокаут-моделей, а целевая проверка генов с использованием CRISPR / Cas9 является одним из наиболее широко используемых применений CRISPR / Cas93. Успех редактирования генов зависит от способности вводить инструменты CRISPR (направляющие РНК и нуклеазу Cas9) в модель клеток-мишеней, что может быть проблемой во многих труднопереводимых клетках, таких как мышечные клетки4. Эта проблема может быть преодолена с помощью вируса, обычно лентивируса, который имеет большое преимущество для эффективного преобразования многих типов клеток и доставки их трансгена. Но его основным недостатком является интеграция трансгена в геном клетки-хозяина, что приводит к потенциальному изменению генов, локализованных в месте интеграции, и к постоянной экспрессии трансгена, что в случае нуклеазы Cas9 приведет к разрушительным последствиям5. Умный раствор был предложен Мерьенн и его коллегами6, который состоит из введения в клетки направляющей РНК, нацеленной на сам ген Cas9, что приводит к инактивации Cas9. Адаптация этой стратегии представлена здесь в виде удобного и универсального протокола, позволяющего нокаутировать практически любой ген в труднотрансфектируемых клетках.

Целью представленного здесь протокола является индуцирование инактивации гена, представляющего интерес, в увековеченных мышечных клетках. Его можно использовать для нокаутирования любого гена, представляющего интерес, в различных типах увековеченных клеток. Протокол, описанный здесь, содержит шаги по разработке направляющих РНК и их клонированию в лентивирусные плазмиды, для производства инструментов CRISPR в лентивирусных векторах, для трансдукции клеток с различными лентивирусами и для клонирования клеток для получения однородной отредактированной клеточной линии.

Используя этот протокол, были разработаны увековеченные клетки скелетных мышц человека с делецией рецептора рианодина типа 1 (RyR1), важного кальциевого канала, участвующего во внутриклеточном высвобождении кальция и сокращении мышц7. Нокаут (KO) гена был подтвержден на уровне белка с использованием вестерн-блоттинга и на функциональном уровне с использованием кальциевой визуализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Биопсии мышц были получены из Банка тканей для исследований (Myobank, партнер в сети ЕС EuroBioBank, Париж, Франция) в соответствии с европейскими рекомендациями и французским законодательством. Письменное информированное согласие было получено от всех лиц. Увековеченные миобласты были любезно изготовлены доктором В. Мули (Институт миологии, Париж, Франция), а протоколы были одобрены этическим комитетом Института миологии (MESRI, n AC-2019-3502).

1. Дизайн руководства CRISPR

  1. Определите область гена, подлежащего удалению. Найдите его геномную последовательность с помощью инструментов браузера генома, таких как ensembl.org или genome.ucsc.edu и определите хромосомные координаты двух областей, чтобы найти направляющую РНК (гРНК) по обе стороны области, подлежащую удалению.
    1. Для гена, используемого здесь, получите последовательность FASTA гена RYR1 и последовательность экзона 101 следующим образом. В ensembl выполните поиск RYR1 в самой последней версии генома человека, выберите первую запись и нажмите на расшифровку кодирующей последовательности белка. Затем нажмите на Exons , чтобы перенаправить на список экзонов гена.
    2. Нажмите «Загрузить последовательность» и выберите «Только геномная последовательность », чтобы загрузить полную консенсусную последовательность всего гена. Прокрутите вниз список экзонов и интронов гена и выберите целевой (ы).
    3. Найдите соответствующую нуклеотидную последовательность в гене. Выберите нуклеотидные последовательности интронов непосредственно вверх и вниз по течению экзона, которые будут удалены, которые будут использоваться для поиска гРНК.
  2. Разработайте две гРНК, называемые здесь руководством 1 и руководством 2, в регионах, определенных на этапе 1.1 (интроны вверх и вниз по течению региона, подлежащего удалению), используя онлайн-инструменты, такие как Crispor.tefor.net8. Выберите две гРНК, разделенные несколькими сотнями пар оснований (bp), причем последовательность каждой гРНК составляет ровно 20 нуклеотидов в длину без смежного мотива протоспейсера (PAM). Выберите лучшие доступные направляющие, чтобы ограничить выход за пределы цели. Пример проектирования направляющих приведен на рисунке 1 .
    1. Ожидается, что последовательность между двумя направляющими будет удалена и, что приведет к выбиванию интересующего гена, таким образом, выберите положение двух направляющих таким образом, чтобы оно удалило существенную последовательность или существенный экзон в интересующем гене. Убедитесь, что удаленная последовательность/экзон не присутствует исключительно в альтернативном транскрипте гена и/или что он кодирует важную часть белка, таким образом, его делеция приведет к функциональному нокауту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя предполагается, что участок расщепления Cas9 произойдет в 3 bp выше по течению от смежного мотива протоспейсера (PAM), расщепление на большем расстоянии также может произойти, поэтому хорошее решение не должно зависеть от точной локализации места расщепления, такого как расщепление в интроне.
  3. Определите последовательность обратного комплемента (RC) для каждой гРНК без PAM, чтобы иметь следующие последовательности: Guide 1 и Guide 1-RC, Guide 2 и Guide 2-RC.
  4. Закажите праймеры, представленные в таблице 1 , для выполнения клонирования плазмид. На протяжении всего протокола применяют праймеры в концентрации 10 нМ в стерильномН2О.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности, добавленные к гРНК в этих праймерах (выделенные жирным шрифтом и подчеркнутые), соответствуют последовательности плазмиды до и после направляющей, промоторной и трансактивирующей CRISPR РНК (тракрРНК) соответственно и не должны модифицироваться для обеспечения хорошего перекрытия между праймерами и плазмидой.

2. Плазмидное клонирование

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе гРНК будут вставлены в плазмидную основу для производства лентивируса. Кассета, кодирующая две гРНК, сначала производится путем последовательных полимеразных цепных реакций (ПЦР) с использованием перекрывающихся праймеров. Затем новая кассета вставляется в лентивирусную основную плазмиду #87919.

  1. Получите следующие плазмиды: плазмиду #87919, кодирующую направляющие РНК CRISPR в лентивирусном векторе и плазмиду #87904, кодирующую последовательность SpCas9 в лентивирусном векторе.
  2. Кассетная конструкция
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол о клонировании кратко изложен в Рисунок 2.
    1. Запустите реакцию ПЦР (А) с 2 мкл плазмиды #87919, 2 мкл primer_XmaIF, 2 мкл primer_Guide1R, 25 мкл полимеразной смеси и 19 мклН2О. Запустите следующую программу ПЦР (программа 1): начальная денатурация 5 мин при 98 °C, за которой следуют 30 циклов: 30 с при 98 °C, 30 с при 60 °C, 1 мин 45 с при 72 °C и конечное удлинение 7 мин при 72 °C. Tm грунтовок, описанных на шаге 1.4, составляет 60 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя время удлинения в программе 1 кажется довольно длительным, это время удлинения было выбрано для обеспечения производства достаточного количества материала нужного размера. Действительно, из-за повторяющихся последовательностей в плазмиде (последовательность тракрРНК после проводников РНК повторяется три раза в плазмиде #87919) ПЦР-амплификация ожидаемой ДНК затруднена, и в последовательных ПЦР образуются дополнительные более мелкие полосы. Таким образом, из-за конкуренции между различными продуктами ПЦР для длинного фрагмента было увеличено либо время удлинения (в пользу самого длинного и достаточного количества очищенного материала в конце), либо для длинного фрагмента была использована ПЦР (программа 2), как описано для ПЦР (заключительная) на этапе 2.2.6).
    2. Отделите продукты ПЦР на 1% агарозном геле в буфере Tris-Borate-EDTA (TBE), рассейте и очистите фрагмент 300 bp. Выполните очистку с помощью специального комплекта в соответствии с инструкцией производителя, с элюированием в конечном объеме 20 мкл. Либо используйте очищенный фрагмент напрямую, либо храните при -20 °C для шага 2.2.5.
    3. Запустите реакцию ПЦР (B) с 2 мкл плазмиды #87919, 2 мкл primer_Guide1F, 2 мкл primer_Guide2R, 25 мкл полимеразной смеси и 19 мклH2Oс использованием программы ПЦР 1. Отделите продукты ПЦР на 1% агарозном геле в ТБЭ, рассейте и очистите фрагмент 400 bp в 20 мкл буфера элюирования. Либо используйте очищенный фрагмент непосредственно, либо храните при -20 °C для шага 2.2.5.
    4. Запустите реакцию ПЦР (С) с 2 мкл плазмиды #87919, 2 мкл primer_Guide2F, 2 мкл primer_BlpIR, 25 мкл полимеразной смеси и 19 мклH2Oс использованием программы ПЦР 1. Отделите продукты ПЦР на 1% агарозном геле в буфере TBE. Акцизируйте и очистите фрагмент 600 bp в 20 мкл буфера элюирования. Либо используйте очищенный фрагмент непосредственно, либо храните при -20 °C для шага 2.2.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть виден еще один фрагмент при 900 bp из-за гибридизации праймера на повторяющихся областях в плазмиде, как описано в ПРИМЕЧАНИИ к шагу 2.2.1. Если она присутствует, эта полоса должна быть отброшена.
    5. Запустите реакцию ПЦР (D) с 2 мкл элюирования ПЦР А (со стадии 2.2.2), 2 мкл элюирования ПЦР В (со стадии 2.2.3), 2 мкл primer_XmaIF, 2 мкл primer_Guide2R, 25 мкл полимеразной смеси и 19 мклH2Oс программой ПЦР 1. Отделить продукты ПЦР на 1% агарозном геле в буфере TBE; иссечь и очистить фрагмент 700 bp в 20 мкл буфера элюирования. Либо используйте очищенный фрагмент непосредственно, либо храните при -20 °C для шага 2.2.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие полосы могут быть видны при >1000 bp, 400 bp и 300 bp из-за гибридизации праймеров на повторяющихся областях и должны быть отброшены.
    6. Запустить ПЦР (конечную) реакцию с 4 мкл элюирования ПЦР С (со стадии 2.2.4), 4 мкл элюирования ПЦР D (со стадии 2.2.5), 4 мкл primer_XmaIF, 4 мкл primer_BlpIR, 50 мкл полимеразной смеси и 34 мклН2О. Используется следующая программа (программа ПЦР 2): начальная денатурация в течение 5 мин при 98 °C; шесть циклов: 30 с при 98 °C, 30 с при 66 °C (снижение температуры гибридизации на 1 °C за цикл), 1 мин 45 при 72 °C; 35 циклов: 30 с при 98 °C, 30 с при 60 °C, 1 мин 45 при 72 °C и конечное удлинение 5 мин при 72 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа ПЦР для этой окончательной амплификации представляет собой ПЦР с касанием, отличающуюся от предыдущей, из-за большого размера конечной амплификации, которая содержит две повторяющиеся последовательности тракрРНК сразу после каждого проводника.
    7. Отделить продукты ПЦР на 1% агарозном геле в буфере TBE; иссечь и очистить конечную кассету, которая мигрирует примерно на 1 300 bp в 20 мкл буфера элюирования. Количественно оцените элюированный продукт. Либо используйте очищенный фрагмент непосредственно, либо храните при температуре -20 °C для этапа 2.3.2.1. Это конечный продукт, который будет вставлен в лентивирусную плазмиду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие фрагменты могут быть видны при >1000 bp, 400 bp и 300 bp, что соответствует неполным фрагментам ПЦР, которые должны быть отброшены.
  3. Вставка кассеты гРНК в лентивирусную плазмидную магистраль.
    1. Линеаризация плазмиды путем двойного переваривания плазмиды No87919 с ферментами рестрикции XmaI и BlpI.
      1. Готовят реакцию с 15 мкл рекомендуемого буфера, 15 мкл плазмиды (1 мкг/мкл), 7,5 мкл фермента BlpI (при 10 Ед/мкл), 7,5 мкл фермента XmaI (при 10 Ед/мкл) и 112,5 мклН2О. Инкубата в течение 1 ч при 37 °С, а затем в течение 20 мин при 65 °С. Загрузите общее количество на 1% агарозный гель, вырежьте и очистите плазмиду ~10 кб с помощью соответствующего набора. Элюирование выполняют в 20 мкл буфера, а элюированный продукт количественно определяют с помощью измерения оптической плотности.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующий протокол очистки для больших фрагментов ДНК, такой как протокол, описанный Sun и coll9.
    2. Лигат кассеты гРНК и плазмиды. Готовят реакционную смесь с кассетой гРНК со стадии 2.2.7 и линеаризированной плазмидой со стадии 2.3.1.1, добавляют 2 мкл фермента иН2О, чтобы иметь конечный объем 10 мкл. Инкубат в течение 15 мин при 50 °С для получения конечной плазмиды, называемой p_guides.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кассеты ДНК должно составлять от 50 до 100 нг, а количество плазмиды - от 100 до 200 нг с молярным соотношением 2:1.
  4. Используйте 2 мкл свежеприготовленной плазмиды для преобразования химически компетентной кишечной палочки , такой как Stbl3 (50 мкл) или XL10-Gold, и наносите на агаровую пластину LB со 100 мкг/мл ампициллина после 1 ч роста при 37 °C без антибиотика. Инкубировать при 37 °C в течение ночи. Выберите несколько колоний и выполните мини-подготовку, используя коммерческий комплект, следуя инструкциям производителя.
  5. Выполните амплификацию ПЦР на днк минипрепа с Primer_XmaI и Primer_BlpR с помощью программы ПЦР 1 (см. Рисунок 2). Отделите продукты ПЦР на 1% агарозном геле в буфере TBE. Выберите несколько колоний (~5) с полосой ожидаемого размера около 1300 bp.
  6. Выполняют секвенирование ДНК выбранных колоний, используя Primer_XmaI или Primer_BlpR, для подтверждения правильной вставки кассеты гРНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна из проверенных последовательностей колоний дополнительно используется в исследовании, а плазмида называется p_guides.
  7. Повторите шаг 2.2 (конструкция кассеты) с Primers-Killer F и R, а также Primers-mCherry F и R. Используйте одну колонию, проверенную последовательностью, для дальнейшего анализа. Плазмида называется p_Killer.

3. Лентивирусная продукция

  1. Производят и очищают большое количество всех необходимых плазмид с помощью комплекта макси-подготовки без эндотоксинов в соответствии с инструкциями производителя. Приготовьте аликвоты при 2 мкг/мкл. Хранить при -20 °C
  2. Подготовка клеток (День 1)
    1. Приготовьте 18 пластин по 145 см, посеянных 1 х 106 клетками HEK293 на пластину в 16 мл среды, состоящей из модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием пирувата глюкозы, дополненного 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином / стрептомицином. Усиливают клетки при 37 °C, в 5% CO2 инкубаторе в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Производство лентивируса должно осуществляться с осторожностью в лаборатории уровня биобезопасности 2 с использованием адаптированных средств защиты, включая одноразовый защитный костюм, защитный колпачок и перчатки. Все эксперименты должны проводиться под ламинарной проточной вытяжкой (шкаф безопасности BSLII) с наконечниками фильтров. Весь раствор, содержащий лентивирусы, и все использованные пластиковые/стеклянные отходы должны быть инактивированы этанолом 70% или другим инактиватором вируса.
  3. Трансфекция клеток (День 4)
    1. Проверьте слияние ячеек, чтобы убедиться, что они достигли 60-65% слияния.
    2. Приготовьте трансфекционный раствор, содержащий для каждой пластины: 20,8 мкг интересующей плазмиды (p-гиды, или p-киллер, или pCas9 #87904), 4,8 мкг плазмиды, кодирующей оболочку (VSV-G, #8454), 20,8 мкг плазмиды psPAX2 (#12260) для лентивирусной упаковки, 136 мкл фосфата кальция и отрегулируйтеh2Oдо конечного объема 1000 мкл. Добавьте этот раствор по каплям и под перемешиванием до 1 мл 2x HEPES-буферизованного физиологического раствора (HBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не готовьте смесь для всех пластин одновременно, чтобы обеспечить оптимальную подготовку реагентов; приготовьте смесь для шести тарелок одновременно, например, для 18 тарелок, приготовьте три раза смесь для шести тарелок.
    3. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение не менее 10 мин и добавлять 2 мл раствора по каплям в клетки. Гомогенизируют трансфекционный реагент с мягким перемешиванием пластины назад, вперед, вверх и вниз, инкубируют при 37 °C, 5% CO2 в течение не менее 5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента и до конца производства лентивируса носите дополнительное защитное снаряжение, включая вторую пару перчаток, защитные рукава и одноразовый пластрон.
    4. Через пять часов после трансфекции удалите среду с пластин и промойте PBS, чтобы избавиться от трансфекционных реагентов. Добавить 12 мл свежей среды и инкубировать 48 ч при 37 °C, 5% CO2.
  4. Сбор вирусных частиц (День 6)
    1. Соберите и объедините среду со всех тарелок. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 °С, до гранулированного клеточного мусора. Фильтруйте супернатант с помощью фильтра 0,45 мкм (требуется несколько фильтров).
    2. Центрифуга при 68 300 х г в течение 2 ч при 4 °C в качающемся роторе ковша. Удалите супернатант и дайте трубкам перевернуться под шкафом безопасности на бумаге в течение 5-10 минут, чтобы удалить как можно больше жидкости, а затем добавьте 100 мкл пролиферационной среды HEK на гранулу. По крайней мере через 2 ч при 4 °C повторно суспендируйте гранулы путем пипетки вверх и вниз. Объедините все повторно суспендированные гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы можно оставить в среде на ночь при температуре 4 °C перед аликотированием.
    3. Лентивирус Аликвот в размере образца 10 мкл или 25 мкл (в зависимости от применения) и мгновенно замораживает жидким азотом. Хранить при температуре -80 °C. Не замораживайте аликвоту, которая была разморожена.
  5. Повторите шаги с 3.2 по 3.4 с другими интересующими плазмидами, чтобы получить LV-направляющие, LV-Killer и LV-Cas9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы лентивирусы можно приобрести у компании или вирусного учреждения.

4. Титрование лентивируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Титрование вируса проводится на клетках HEK293. Титрование важно включить в последующие этапы точное количество лентивирусов на клетку (независимо от партии лентивируса) для интересующих клеток. Количество вирусных частиц, которые эффективно трансдуцируют клетку, называется множественностью инфекции (MOI): MOI 10, таким образом, соответствуют введению 10 вирусных частиц на клетку. Поскольку цикл замораживания/оттаивания влияет на жизнеспособность лентивируса, титрование проводят с замороженной лентивирусной аликвотой, и каждый последующий эксперимент будет проводиться с новой аликвотой того же пула. Один метод титрования описан здесь, но могут быть использованы и другие методы.

  1. На 1-й день высевают 1 х 105 ячеек на пластину в пяти 35-мм пластинах со стеклянными крышками на дне и двух 35-мм пластинах без чехлов.
  2. На 2-й день из двух пластин без обшивки соберите и подсчитайте количество клеток после трипсинизации и определите среднее количество клеток на пластину (N).
  3. Готовят 100 мкл лентивируса, разведенного на 1/10 в пролиферационной среде. Трансдуцируют пять культивируемых пластинок с различными объемами разбавленного вируса, от 1 до 50 мкл разбавленного вируса. Для этого протокола используют следующие объемы для преобразования пяти пластин: 1 мкл, 5 мкл, 10 мкл, 20 мкл, 50 мкл. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C, в 5% CO2.
  4. На 4-й день фиксируют клетки путем инкубации покровных пластинок при RT в течение 20-30 мин в 4% параформальдегиде. Для LV-Cas9 пропитывают клетки 0,1% тритона X100 в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) в течение 10 мин при RT, насыщают в PBS-0,1% Triton X100-2% Козьей сыворотки - 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 20 мин при RT и этикетку в течение 45 мин при RT с первичным антителом анти-V5 (разведение 1/400) с последующей 30-мин инкубацией в RT с флуоресцентным вторичным антителом. Маркируйте ядра Хештом (10 мкг/мл в PBS) в течение 10 мин при RT.
  5. Установите крышки на слайд и наблюдайте с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного 20-кратным объективом. Для LV-направляющих и LV-Killer после фиксации переходят непосредственно к маркировке ядер и монтируют крышки. Для каждого облицовочного листа подсчитайте общее количество ядер (общее количество клеток) в поле зрения и количество помеченных клеток (либо V5, либо mCherry) и определите соотношение клеток, помеченных для каждого облицовочного листа.
  6. Выберите крышку, в которой соотношение трансдуцированных клеток составляет не менее 10% и не превышает 50%. Определите эффективность трансдукции (X) для этого покровного листа и обратите внимание на объем разбавленного вируса (V, в мкл), используемого для получения этой эффективности трансдукции.
    Equation 1
  7. Определяют титр (в инфекционных частицах, представленных в виде ip/mL) вируса по следующей формуле:
    Equation 2
    Коэффициент разбавления представляет собой разбавление лентивируса, выполненное на стадии 4.3. Мы регулярно получаем окончательный титр 1 x 109 ip/mL для LV-Cas9 и 1 x 1010 ip/mL для LV-направляющих, определяемый в ячейках HEK.

5. Миобластная трансдукция

ПРИМЕЧАНИЕ: Увековеченные миобласты последовательно трансдуцируются тремя ранее продуцированными лентивирусами. Они поддерживаются при плотности ниже 50% в пролиферационной среде, состоящей из F10 Хама, дополненной 20% FBS, 2% пенициллина / стрептомицина, 2% Ultroser G и культивируемой при 37 ° C, 5% CO2.

  1. Определить объем лентивируса необходимо для лечения выбранного количества клеток с помощью MOI 10 для LV-Cas9 и LV-гидов и MOI 20 для LV-киллера, по следующей формуле:
    Equation 3
    ПРИМЕЧАНИЕ: В параллельном эксперименте эффективность трансдукции сравнивалась на миобластах и HEK с использованием контрольного лентивируса (lenti-GFP), и мы определили, что для эффективной трансдукции миобласта требуется в пять раз больше лентивирусов по сравнению с клеткой HEK. Таким образом, MOI 10, измеренный на HEK, соответствует двум вирусным частицам на миобласт. Используемые здесь MOI рассчитываются на клетках HEK.
  2. На 1-й день высевают 96-луночные пластины с 10 000 клеток в 100 мкл пролиферационной среды на лунку. На 2-й день переведите ячейки под шкаф безопасности, добавив соответствующий объем LV-направляющих и LV-Cas9, рассчитанных на шаге 5.1. Верните клетки в инкубатор до 7 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование MOI выше 25, особенно для LV-Cas9, может не улучшить количество отредактированных клеток из-за более высокой гибели клеток при высокой концентрации лентивируса.
  3. На 7 день выполняют трипсинизацию и подсчитывают клетки. Засейте клетки при слиянии от 40% до 50% в новую пластину и верните клетки в инкубатор. Через пять часов трансдуцируют клетки с помощью LV-киллера при MOI 20 (объем, рассчитанный на шаге 5.1). Амплируйте клетки в течение 5-10 дней после трансфекции, по крайней мере, в течение двух проходов, и всегда поддерживайте их при низкой конфюминации <50%. Клетки готовы к следующему этапу, клеточному клонированию, когда их рост возвращается к норме (оценивается по времени деления).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пролиферация может быть немного медленнее после трансдукции. Нормальный рост клеток может быть определен до этой экспериментальной процедуры путем оценки времени деления клеток.

6. Клеточное клонирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку трансдукция миобластов затруднена и никогда не достигает 100% эффективности, даже при использовании лентивируса требуется клеточное клонирование, чтобы получить полностью скорректированную клеточную линию. Это возможно только с увековеченными клетками или клетками, которые могут быть культивированы и усилены в течение нескольких недель / месяцев.

  1. Трипсинизируют и подсчитывают клетки. Разбавьте клетки в пролиферационной среде при 10 клетках/мл и засейте клетки в 1 клетку/лунку в 96-луночных пластинах, содержащих 100 мкл/лунку среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество пластин, подлежащих посеву, зависит от вероятности ожидаемого редактирования генов, обычно используется от 2 до 10 пластин.
  2. Следите за ростом клеток и постепенно усиливайте каждую лунку в более крупной пластине, пока не достигнете по крайней мере 35 мм пластины, сохраняя при этом слияние миобластов ниже 50%. Этот шаг может длиться 2-6 недель, в зависимости от используемых клеток и их способности расти после выделения в колодце.

7. Выбор клонирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для определения того, какие из растущих клонов были соответствующим образом изменены.

  1. Спроектируйте набор грунтовок, состоящих из грунтовки, расположенной перед первой направляющей (Primer_BeforeGuide1F), и другой грунтовки, расположенной после второй направляющей (Primer_AfterGuide2R), чтобы усилить область, заключающую предположительно измененную последовательность. Грунтовки, используемые здесь, см. в таблице 1 .
  2. Соберите клетки из каждого клона, сохраните не менее 300 000 клеток для будущей амплификации и извлеките геномную ДНК, используя любой стандартный протокол на оставшихся клетках.
    1. Если растет большое количество клонов, чтобы отбросить неотредактированные, выполните экспресс-тест, объединив клетки из пяти клонов в одной трубке, чтобы извлечь ДНК из этого пула и протестировать с помощью ПЦР. Повторите с таким количеством клонов, сколько необходимо. Затем отделите пулы, которые содержали отредактированные клетки, для выполнения индивидуального анализа.
  3. Контролируйте редактирование с помощью ПЦР следующим образом. Готовят реакцию ПЦР с 1 мкл Primer_BeforeGuide1F, 1 мкл Primer_AfterGuide2R, 12,5 мкл полимеразной смеси, 3 мкл геномной ДНК и 7,5 мклН2О. Амплифицируют в термоциклере в соответствии с инструкциями производителя и параметрами праймеров. Используйте 1% агарозный гель для идентификации отредактированных клонов.
  4. Управляйте редактированием с помощью последовательности следующим образом. Выполните секвенирование выбранных клонов Сэнгером, чтобы подтвердить удаление и определить, как редактирование было выполнено в каждом клоне. Сохраните более одного отредактированного клона, чтобы убедиться, что только целевой ген был модифицирован и отвечает за наблюдаемый физиологический эффект, и сохраните неотредактированный клон, который будет использоваться в качестве контрольного клона (CTRL) в последующих экспериментах.
  5. Разверните выбранные клоны. Как только слияние каждого клона достигнет около 50%, трипсинизируют клетки и помещают клетки в большую чашку, пока не будет произведено достаточное количество клеток для выполнения биохимических и функциональных характеристик (обычно более 1 х 106 на клон), и храните замороженные аликвоты каждого клона для будущего использования.

8. Характеристика отредактированных клонов

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как несколько клонов были выбраны и подтверждены секвенированием ДНК, делеция целевого гена может быть подтверждена на уровне белка с использованием вестерн-блот и на функциональном уровне, если функциональный клеточный анализ доступен для этого гена. В случае RYR1-KO, поскольку RyR1 является кальциевым каналом, функциональная характеристика была выполнена с использованием кальциевой визуализации на культивируемых клетках.

  1. Экспрессия белка в отредактированных клонах
    ПРИМЕЧАНИЕ: RyR1 экспрессируется только в дифференцированных миотубах10. Его экспрессия была оценена в миотрубах с использованием вестерн-блоттинга, чтобы подтвердить делецию на уровне белка RyR1, а также делецию белка Cas9.
    1. Пластина 200 000 клеток в пролиферационной среде (описанная выше, стадия 5) на поверхности около 1,76см2 в пластине размером 35 мм, покрытой ламинином (поверхность, соответствующая капле ламинина 200 мкл при 10 мг/мл в PBS с кальцием). Как только клетки прилипнут к пластине после инкубации в течение 2-3 ч при 37 °C, 5% CO2, переложите культуральную среду на среду дифференцировки, состоящую из DMEM с низким содержанием глюкозы + 10% сыворотки лошади + 1% пенициллина / стрептомицина, и верните клетки в инкубатор в течение 6 дней.
    2. После 6 дней дифференцировки собирают и лизируют клетки 200 мкл RIPA, дополненного ингибиторами протеазы. Определяют концентрацию белка с помощью метода11 Фолина Лоури.
    3. Загрузить 15 мкг белка, после денатурации в течение 30 мин при РТ в денатурационном буфере Леммли, на 5%-15% градиентный акриламидный гель. После электрофоретического разделения переносят белки на Иммобилон Р при 0,8 В в течение 4 ч11.
    4. После насыщения мембраны в течение 30 мин при RT в PBS, содержащей 0,1% Tween 20 и 5% обезжиренного сухого молока, инкубируют мембрану с первичными антителами, разведенными в том же буфере в течение 2 ч при RT или на ночь при 4 °C, промыть мембрану 5x в течение 5 мин PBS-0,1% Tween 20 и инкубировать мембрану с вторичными антителами в течение 1 ч при RT. Основными используемыми антителами являются: антитела против V5-метки (разведение: 1/5000) для обнаружения Cas9, анти-GAPDH (разведение: 1/1000) в качестве контроля нагрузки, анти-RyR1 антитело 12,13 (разведение: 1/10.000), антитело против альфа-1 субъединицы DHPR (разведение: 1/1000) и антитело против тяжелой цепи миозина MF20 (разведение: 1/1000).
    5. Промыть мембрану 5х в течение 5 мин PBS-0,1% Tween 20, высушить избыток жидкости и добавить хемилюминесцентную субстрату. Действуйте в соответствии с рекомендациями поставщика субстрата для обнаружения хемилюминесцентного сигнала.
  2. Функциональная характеристика отредактированных клонов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Функцию RyR1 оценивали с помощью кальциевой визуализации в дифференцированных миотрубах, полученных из клонов CTRL или KO14.
    1. Пластина 50 000 клеток на поверхности 0,2см2 в центре 35 мм посуды покрыта ламинином (поверхность, покрытая каплей ламинина 50 мкл, при 10 мг/мл в PBS кальцием) и индуцируют дифференцировку в течение 6 дней, как описано на этапе 8.1.1. Подготовьте три тарелки для каждой стимуляции, чтобы иметь биологический трипликат.
    2. Нагружают миотрубы 50 мкл флуо-4-прямого, разбавляют 1:1 в дифференцировочной среде и инкубируют в течение 30 мин при 37 °С. Промыть клетки дважды буфером KREBS, дополненным глюкозой в 1 мг/мл.
    3. Измерьте вариации флуоресценции с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа или конфокального микроскопа с помощью 10-кратного объектива. Установите пластину на ступень микроскопа и начните съемку со скоростью 1 кадр в секунду в течение 90 с.
    4. Удалить оставшиеся KREBS и стимулировать клетки в рамке 25 путем добавления 2 мл KCl для мембранной деполяризации (конечная концентрация 140 мМ) или 2 мл 4 CmC (конечная концентрация 500 мкМ) для прямой стимуляции RyR1. Убедитесь, что в зарегистрированном поле присутствует не менее 10 миотубов.
    5. Количественно оцените вариации флуоресценции в каждой миотубе, используя специальное программное обеспечение. Выберите для анализа не менее 10 миотуб на блюдо (в идеале 20-30 миотуб на блюдо), нарисуйте линию (или область интереса (ROI)) на длинной оси каждой миотрубы и соберите флуоресценцию F вдоль этой линии для всех кадров.
    6. Определите начальное значение флуоресцента F0, соответствующее кадрам от 1 до 24. График флуоресцентного изменения (F-F0)/F0 в зависимости от времени от 0 до 90 с. Повторите эксперимент три раза, чтобы получить вариацию флуоресценции по меньшей мере из 90 миотубок из трех разных культур. Объедините все результаты для 90 миотуб и рассчитайте средний ± SEM (F-F0)/F0 на каждом временном интервале. Количественно оцените пиковую амплитуду высвобождения кальция для каждой стимуляции и каждого клона.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол был применен к увековеченным миобластам от здорового субъекта15 (так называемые клетки HM, для миобластов человека), в которых RyR1 ранее был охарактеризован16, чтобы выбить ген RYR1 , кодирующий белок RyR1. Конструкция направляющей РНК была сделана для удаления последовательности, охватывающей часть экзона 101 и интрона 101 гена. Предполагается, что удаление части экзона 101 приведет к нарушению кадра считывания. Кроме того, экзон 101 кодирует поры белка и, таким образом, необходим для получения функционального кальциевого канала. Многие пациенты, страдающие тяжелой миопатией, связанной с RyR1, имеют мутацию в этой области гена7. Лучшие руководства, предсказанные с помощью программного обеспечения Crispor, были выбраны для того, чтобы иметь как можно меньше нецелей, сохраняя при этом наилучшую эффективность. Мы решили использовать два гида одновременно в одном и том же вирусном векторе, чтобы убедиться, что большая часть клеток будет нокаутирована, и облегчить обнаружение делеции в отредактированных клонах с помощью ПЦР. Два выбранных направляющих (см. Таблицу 2 и Рисунок 1) локализованы, соответственно, в конце экзона 101 и в начале интрона 101, что приводит к удалению 326 bp и последующему сдвигу кадра. Это гарантирует, что отредактированные ячейки будут RYR1-KO.

ГРНК, нацеленная на SpCas9, была уже разработана Мерьенном и его коллегами6 и присутствовала в плазмиде #87919 под слабым промотором 7SK. Поскольку его эффективность для нацеливания на последовательность SpCas9 уже была продемонстрирована в их исследовании6, он был использован для создания плазмиды p_Killer, но под контролем сильного промотора H1. Второй проводник в плазмиде p_Killer предназначен для нацеливания на последовательность mCherry под промотором U6. Это позволит удалить mCherry, что может беспокоить в некоторых последующих экспериментах с вновь созданной клеточной линией.

Плазмиды p_guides и p_killer были созданы, и все необходимые лентивирусы были произведены в специальной комнате культуры BSL2. После трансдукции миобластов клетки культивировали в течение 2 недель до восстановления роста и анализировали с помощью ПЦР для подтверждения наличия отредактированных клеток. Для клеточного клонирования две 96-луночные пластины были засеяны обработанными клетками по 1 клетке на лунку. Рост клеток наблюдался в 32% культивируемых лунок. Затем из клонов извлекали геномную ДНК и проводили ПЦР-анализ до тех пор, пока не были идентифицированы два исправленных клона (так называемые Cl-KOR-1 и Cl-KOR-2), см. Рисунок 3. Удаление целевой части RYR1 было подтверждено секвенированием Сэнгера. Были использованы дополнительные контрольные клетки, такие как исходные клетки HM или клетки HM, обработанные той же процедурой, но не отредактированные, что подтверждено ПЦР и секвенированием (Cl-CTRL). Выбранные клоны затем амплировали и дополнительно характеризовали на уровне белка и функциональном уровне.

Чтобы подтвердить полное вымирание RyR1 и Cas9 на уровне белка, был проведен анализ вестерн-блоттинга. Результаты представлены на рисунке 4. Белок Cas9, отсутствующий в клетках HM, был обнаружен через 5 дней после трансдукции клеток LV-Cas9 (HM+LV-Cas9), и, как и ожидалось, его экспрессия была отменена в Cl-CTRL и в отредактированных Cl-KOR-1 и Cl-KOR-2, хотя небольшое количество Cas9 все еще было обнаружено в Cl-KOR-2 (Рисунок 3A). Поскольку гРНК, нацеленная на Cas9, все еще экспрессируется, количество оставшегося Cas9, как ожидается, постепенно исчезнет. Экспрессию других важных белков также оценивали с использованием вестерн-блот: RyR1, для подтверждения полной делеции белка, альфа1-субъединицы DHPR, которая является функциональным партнером RyR1, участвующего в связи возбуждение-сокращение, и тяжелой цепи миозина в качестве маркера дифференцировки, поскольку RyR1 и DHPR экспрессируются только в дифференцированных миотрубах (рисунок 3B). ). DHPR и MYHC не предполагается модифицировать. Хотя вестерн-блот подтвердил полное удаление RyR1 в двух клонах RyR1-KO (Cl-KOR-1 и Cl-KOR-2), дополнительные модификации, возникшие в результате Cas9 или процедуры клонирования, возможно, произошли в Cl-KOR-2, что, кроме того, представляло собой отсутствие DHPR и снижение тяжелой цепи миозина (MHC). Поскольку оба белка экспрессируются только в дифференцированных миотрубах, их отсутствие, скорее всего, отражает изменение дифференцировки, которое может быть связано с длительной процедурой клонирования одиночных клеток, связанной с локальным чрезмерным ростом клеток, приводящим к потере их миогенного потенциала. Таким образом, только Cl-KOR-1 был дополнительно охарактеризован на функциональном уровне. Это показывает, что выбор многочисленных отредактированных клонов важен для работы с лучшими клонами.

Функциональную характеристику проводили с помощью кальциевой визуализации. Среднее изменение флуоресценции в зависимости от времени представлено на фиг.5, по меньшей мере, на 180 миотрубах каждого генотипа, с использованием либо прямой стимуляции RyR1 4-CMC, либо стимуляции комплекса высвобождения кальция (DHPR, связанного с RyR1) деполяризацией мембраны KCl.

Эти эксперименты показали, что немодифицированный Cl-CTRL имел поведение, сопоставимое с исходной клеточной популяцией (клетками HM), и реагировал на прямую стимуляцию RyR1 его активатором 4-CmC и стимуляцией комплекса высвобождения кальция деполяризацией мембраны. Напротив, отредактированный Cl-KOR-1 не смог реагировать ни на одну стимуляцию (деполяризацию 4-CmC и KCl), как это ожидалось для RyR1-KO.

В целом, вестерн-блот и функциональная характеристика подтвердили, что клеточная линия Cl-KOR-1 является мышечной клеточной линией RyR1-KO. Этот протокол может быть применен к любому другому гену, экспрессируемому в скелетных мышцах, или другому типу клеток (например, индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам - iPSC). Полный протокол показан на рисунке 6.

Figure 1
Рисунок 1: Локализация и проектирование направляющих РНК. (А) Схематическая локализация направляющих, предназначенных для создания клеточной линии RYR1-KO. Руководство 1 нацелено на конец экзона 101 в гене RYR1 , руководство 2 нацелено на интрон 101, создавая делецию 326 bp и сдвиг кадра. Guide Killer нацеливается на кодон инициации в последовательности SpCas9, Guide mCherry нацелен на конец последовательности mCherry. (B) Локализация направляющих в геномных последовательностях для ранее описанных Guide 1, Guide 2, Guide killer и Guide mCherry. Последовательность каждого направляющего (длина 20 бит в у..) представлена цветом, а PAM для каждого руководства выделен жирным шрифтом и подчеркнут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Процедура клонирования для изготовления кассеты. Схематическое представление различных ПЦР выполняется для получения кассет с направляющими, которые должны быть вставлены в лентивирусную основную плазмиду. ПЦР А, ПЦР В, ПЦР С и ПЦР Д реализуются с программой 1, проиллюстрированной в правом верхнем углу, и заключительной ПЦР с программой ПЦР 2, проиллюстрированной справа внизу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Выбор клонов с использованием ПЦР. (A) Схематическое представление амплификации ПЦР области 1 200 bp, охватывающей направляющие, с прямыми и обратными праймерами, представленными серыми стрелками. Ожидается, что расщепление ДНК в обоих направляющих приведет к уменьшению на 326 бп в размере фрагмента ПЦР, как показано пунктирными зелеными вертикальными линиями под ножницами. (B) Продукты ПЦР, полученные из клеток HM, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 и Cl-KOR-2, были загружены 1% агарозным гелем. ДНК HM и Cl-CTRL выглядит немодифицированной (полная длина), тогда как ДНК Cl-KOR-1 и Cl-KOR-2 короче контрольной, как и ожидалось (расщеплена). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Характеристика клеток на уровне белка. (A) Вестерн-блоттинговый анализ на наличие белка Cas 9 с использованием V5-метки в клетках HM, HM-клеток, трансдуцированных LV-Cas9, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 и Cl-KOR-2. Cas9 четко обнаруживается в клетках HM, трансдуцированных LV-Cas9, тогда как его экспрессия была полностью отменена (в Cl-CTRL и Cl-KOR-1) или почти полностью (в Cl-KOR-2) LV-Killer. (B) Экспрессия RyR1, тяжелой цепи миозина (MYHC), альфа1-субъединицы DHPR и GAPDH в качестве регулятора нагрузки в Cl-CTRL, Cl-KOR-1 и Cl-KOR-2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Функциональная характеристика клеток. Визуализация кальция Fluo-4 выполняется на миотрубах, полученных из клеток HM, Cl-CTRL и Cl-KOR-1. Кривые представляют вариацию флуоресценции в миотубах HM (черные кривые), миотрубах Cl-CTRL (серые кривые) или Cl-KOR-1 (зеленые кривые). Все значения представлены как среднее ± стандартной погрешности среднего (SEM) n миотуб. В каждом состоянии n = от 180 до 256 миотрубок были проанализированы, по крайней мере, из трех различных экспериментов (точное число, указанное для каждой кривой). 4 CmC (500 мкМ) использовали для непосредственной стимуляции RyR1 в присутствии 2 мМ внешнего кальция. Деполяризация KCl (140 мМ) индуцировалась в присутствии 2 мМ внешнего кальция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Схематическое представление всего протокола. Представлены различные этапы протокола, от дизайна in silico до молекулярного клонирования in vitro и окончательного выбора клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Имя Последовательность 5'-3' Назначение/Использование
Primer_Guide1F Guide1 + gttttagagctagaaatagc Клонирование плазмид
Primer_Guide1R Руководство 1-RC +AGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_Guide 2F Путеводитель 2 + gttttagagctagaaatagc
Primer_Guide 2R Руководство 2-RC + GTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_XmaI Ф TAGTGGATCCCCCGGGAAAATTCAAAATTTT Клонирование плазмид и контроль колоний
Primer_BlpI Р CGCTTCCATTGCTCAGCTGGCCGCTGCCCC
Primer_KillerF AATGGAGTACTTCTTGTCCAgttttagagctagaaatagc Клонирование плазмидных p_Killer
Primer_KillerR TGGACAAGAAGTACTCCATTAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_mCherryF GAACAGTACGAACGCGCCGAgttttagagctagaaatagc
Primer_mCherryR TCGGCGCGTTCGTTCGTGTTCGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_RYR1exonF GCTCGTATTCGTCACCCGCGgttttagagctagaaatagc Клонирование плазмидных p_guides_RyR1
Primer_RYR1exonR CGCGGGTGACGAATACGAGCAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_RYR1intronF TAAGTCAGTTCATAGGCGCTgttttagagctagaaatagc
Primer_RYR1intronR AGCGCCTATGAACTGACTTAGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_BeforeRYR1cut AGTCGTTACCATGTCTTCAGCCCTCT Выбор клонов для RYR1 KO
Primer_AfterRYR1cut CTGCCGATTCCACAGATGAAGCAC

Таблица 1: Перечень грунтовок. Праймеры, используемые для клонирования плазмид и контроля колоний, а также для отбора клонов.

Имя Направляющая последовательность Пэм Обратное комплементирование без PAM
Руководство 1: RYR1exon GCTCGTATTCGTCACCCGCGCG ГГГ CGCGGGTGACGAATACGAGC
Руководство 2: RYR1intron TAAGTCAGTTCATAGGCGCT КГГ AGCGCCTATGAACTGACTTA
Путеводитель Убийца Cas9 TGGACAAGAAGTACTCCATT ГГГ AATGGAGTACTTCTTGTCCA
Путеводитель мВечерри убийца ГААТАГТАКГААКГКЦЦГА ГГГ TCGGCGCGTTCGTGTGTTC

Таблица 2: Направляющие, используемые для создания плазмидных p_guides и p_Killer. Последовательности, используемые для разработки клонов RyR1-KO, представлены в этой таблице.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Важным шагом на пути к характеристике генов неизвестной функции, участвующих в патологиях, является разработка соответствующих клеточных моделей для изучения функции этих генов. Использование редактирования генов с использованием CRISPR / Cas9 является экспоненциально растущей областью исследований, и разработка нокаут-моделей, представленных здесь, является одним из наиболее широко используемых приложений. В этом контексте мы предлагаем здесь универсальный протокол для разработки нокаута клеточной линии человека в любом интересующем гене, позволяющий характеризовать этот ген в соответствующей модели клеток человека. Протокол, представленный здесь, может быть использован в увековеченных миобластах, а также в iPSC, и, таким образом, может фактически привести к производству любой модели клеток человека KO в интересующем гене.

Ограничение заключается в том, что этот протокол должен применяться к увековеченным клеткам, так как требуется много недель культивирования, а также клеточного клонирования наряду с многочисленными последовательными усилениями. В качестве альтернативы следует использовать клетки, которые могут быть усилены и поддерживаться в течение нескольких недель или месяцев. Используя эту процедуру, увековеченная человеком линия мышечных клеток KO для интересующего гена (здесь ген RYR1 ) была произведена примерно за 3-4 месяца (исключая функциональную характеристику клеток).

Эта стратегия подходит для трудно трансфектируемых клеток, таких как мышечные клетки, поскольку она опирается на использование лентивируса для введения всех инструментов в клетки-мишени, и, таким образом, она более мощная, чем другие методы, такие как трансфекция или электропорация. Его основным недостатком является интеграция в геном хозяина, и возможной альтернативой, позволяющей избежать повреждающей интеграции лентивируса в геном хозяина, является использование неинтегративного лентивируса17, но эффективность этих неинтегративных лентивирусных частиц должна быть, по крайней мере, эквивалентна обычному лентивирусу.

Сайт интеграции, вероятно, может повлиять на уровень выражения Cas9, но это, скорее всего, не отвечает за небольшое количество Cas9 в Cl-KOR 2. Небольшое количество Cas9, скорее всего, связано с трансдукцией этого конкретного клона с LV-Killer, который мог быть ниже, чем в другом клоне, или, в качестве альтернативы, количество LV-Cas9 могло быть выше.

Не рекомендуется экспрессировать Cas9 в одиночку без гРНК в течение длительного времени (например, для разработки клона Cas9), так как это было описано для увеличения нецелевых мишеней, а также может увеличить смертность клеток.

Мы решили использовать SpCas9 в качестве нуклеазы, потому что она широко используется, имеет короткий PAM, и поэтому предлагает несколько вариантов выбора направляющих РНК. Кроме того, его размер совместим с продукцией лентивирусных векторов. Другие нуклеазы могут быть использованы, если конкретный PAM должен быть нацелен (например, SaCas9 или Cpf1)18.

Различные лентивирусы могут быть произведены в обычной культурной комнатеBSL2 19 или приобретены на предприятии по производству вирусов или в компании. Требованием для реализации этого протокола является экспертиза в области молекулярной биологии и молекулярного клонирования, а также в культивировании выбранной клеточной модели.

Лентивирусы, кодирующие различные направляющие, также кодируют флуоресцентный белок mCherry. Этот флуоресцентный белок может быть полезен, позволяя автоматизировать сортировку клеток и клонирование с помощью FACS вместо клонирования одной клетки, и в этом случае экспрессия mCherry не должна подавляться LV-киллером. Если mCherry должен быть сохранен, то второе руководство против mCherry не должно быть клонировано в p-киллер (шаг 2.7). Для гена RYR1 , поскольку функциональная характеристика использует флуоресцентные зонды, а будущее использование этой клеточной линии также может потребовать иммуномаркировки флуоресцентными антителами, мы решили подавить экспрессию mCherry. В LV-киллере гРНК, нацеленная на Cas9, была помещена под сильный промотор H1 вместо слабого промотора 7SK, первоначально присутствующего в исходной плазмиде, чтобы обеспечить аналогичную эффективность нуклеазы на всех выбранных гРНК и увеличить расщепление Cas9 после добавления LV-киллера к клеткам.

Самым длинным и напряженным этапом является клонирование одной ячейки. В нашей процедуре мышечные клетки показали снижение роста после лентивирусной трансдукции Cas9 и восстановились через несколько недель. Если клонирование одной клетки выполняется слишком рано после вирусных трансдукций, вероятно, из-за массивной гибели клеток, только несколько лунок 96-луночной пластины будут содержать растущие клетки. Таким образом, лучше усилить клетки перед клонированием, и подождать хотя бы 2-3 расщепления. Также возможно клонирование клеток при 10 клетках / хорошо, если они не растут хорошо, как одиночные клетки. Кроме того, миобласты всегда следует культивировать при слиянии ниже 50%, чтобы сохранить хорошую дифференцированную способность.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась за счет грантов Французской ассоциации по борьбе с миопатиями (AFM-Téléthon) и Овернь-Роны Альпы Режион (AURA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CACNA1S antibody Sigma-Aldrich HPA048892 Primary antibody
Blp I NE BioLabs R0585S Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit Takara 631312  Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG GeneTex GTX221667-01 HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG GeneTex GTX221666 HRP secondary antibody
Fluo-4 direct Molecular Probes F10472 Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb  Cell Signaling Technology #2118 Primary antibody
HindIII Fermentas ER0501 Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus Takara 638920 Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC ThermoFisher Scientific F532L Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody DHSB MF20 Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel REF 740424 Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609 DNA purification
NucleoSpin Tissue Macherey-Nagel 740952 Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli ThermoFisher Scientific C737303 Chemically competent cells
Plasmid #87904 Addgene 87904 Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919 Addgene 87919 Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260 Addgene 12260 Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454 Addgene 8454 Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody Invitrogene R96025  Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 Chemically competent cells
Xma I NE BioLabs R0180S Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
  2. Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
  3. Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
  4. Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
  5. Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
  6. Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
  7. Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
  8. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  9. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  10. Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
  11. Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
  12. Garibaldi, M., et al. Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
  13. Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
  14. Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
  15. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
  16. Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
  17. Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
  18. Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
  19. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).

Tags

Генетика выпуск 184
Разработка нокаутирующих мышечных клеточных линий с использованием лентивирусно-опосредованного редактирования генов CRISPR/Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot,… More

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot, A., Halmai, N. B., Segal, D. J., Rendu, J., Marty, I. Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (184), e64114, doi:10.3791/64114 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter