Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Utvikling av knock-out muskelcellelinjer ved hjelp av lentivirusmediert CRISPR / Cas9 genredigering

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1University Grenoble Alpes, INSERM, U1216, CHU Grenoble Alpes, Grenoble Institut Neurosciences, 2Genome Center, University of California, Davis

Summary

Protokollen beskriver hvordan du genererer knock-out myoblasts ved hjelp av CRISPR / Cas9, fra utformingen av guide-RNAer til cellulær kloning og karakterisering av knock-out klonene.

Abstract

En viktig anvendelse av grupperte regulatoriske interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas 9 er utviklingen av knock-out cellelinjer, spesielt for å studere funksjonen til nye gener / proteiner forbundet med en sykdom, identifisert under den genetiske diagnosen. For utvikling av slike cellelinjer må to store problemer løsnes: innsetting av CRISPR-verktøyene (Cas9 og guiden RNA) med høy effektivitet i de valgte cellene, og begrensning av Cas9-aktiviteten til den spesifikke slettingen av det valgte genet. Protokollen som er beskrevet her, er dedikert til innsetting av CRISPR-verktøyene i vanskelige å transfektceller, for eksempel muskelceller. Denne protokollen er basert på bruk av lentivirus, produsert med plasmider offentlig tilgjengelig, som alle kloningstrinnene er beskrevet for å målrette mot et gen av interesse. Kontrollen av Cas9-aktivitet har blitt utført ved hjelp av en tilpasning av et tidligere beskrevet system kalt KamiCas9, der transduksjonen av cellene med et lentivirus som koder en guide RNA rettet mot Cas9 tillater progressiv avskaffelse av Cas9-uttrykk. Denne protokollen har blitt brukt på utviklingen av en RYR1-knock out menneskelig muskelcellelinje, som har blitt ytterligere karakterisert på protein- og funksjonsnivå, for å bekrefte utslag av denne viktige kalsiumkanalen involvert i muskelintracellulær kalsiumfrigjøring og i eksitasjons-sammentrekningskobling. Prosedyren beskrevet her kan lett brukes på andre gener i muskelceller eller i andre vanskelige å transfektceller og produsere verdifulle verktøy for å studere disse genene i menneskelige celler.

Introduction

Med fremdriften av gensekvensering og identifisering av mutasjoner i gener av ukjente funksjoner i et bestemt vev, utgjør utviklingen av relevante cellulære modeller for å forstå funksjonen til et nytt målgen og bekrefte dets involvering i de relaterte patofysiologiske mekanismene et viktig verktøy. I tillegg er disse modellene av stor betydning for fremtidig terapeutisk utvikling 1,2, og utgjør et interessant alternativ til utvikling av knock-out dyremodeller i rett tråd med de internasjonale anbefalingene for reduksjon i bruk av dyr i eksperimentering. Genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er blant de kraftigste verktøyene som for tiden er tilgjengelige, noe som har gjort det mulig å utvikle mange knock-out/knock-in-modeller, og målrettet genvalidering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er blant de mest brukte bruksområdene til CRISPR/Cas93. Suksessen med genredigering er avhengig av muligheten til å introdusere CRISPR-verktøyene (guiden RNAer og kjernen Cas9) i målcellemodellen, noe som kan være en utfordring i mange vanskelig å transfektceller, for eksempel muskelceller4. Denne utfordringen kan overvinnes ved bruk av virus, vanligvis lentivirus, som har den store fordelen å transdusere effektivt mange celletyper og levere transgene. Men den største ulempen er integrasjonen av transgene i vertscellegenomet, noe som fører til potensiell endring av gener lokalisert på integrasjonsstedet og til det permanente uttrykket av transgene, som i tilfelle av kjernen Cas9 ville føre til skadelige konsekvenser5. En smart løsning er foreslått av Merienne og kolleger6, som består av introduksjon i cellene i en guide-RNA rettet mot Selve Cas9-genet, noe som fører til Cas9-inaktivering. En tilpasning av denne strategien presenteres her som en brukervennlig og allsidig protokoll som gjør det mulig å slå ut praktisk talt ethvert gen i celler som er vanskelige å transfekter.

Målet med protokollen som presenteres her er å indusere inaktivering av et gen av interesse for udødelige muskelceller. Det kan brukes til å slå ut ethvert gen av interesse, i forskjellige typer udødelige celler. Protokollen som er beskrevet her inneholder trinn for å designe guiden RNAer og deres kloning i lentivirale plasmider, for å produsere CRISPR-verktøyene i lentivirale vektorer, for å transdusere cellene med de forskjellige lentivirusene, og å klone cellene for å produsere en homogen redigert cellelinje.

Ved hjelp av denne protokollen er udødeliggjorte humane skjelettmuskulaturceller utviklet med sletting av type 1 ryanodinreseptoren (RyR1), en viktig kalsiumkanal involvert i intracellulær kalsiumfrigjøring og muskelkontraksjon7. Utslag (KO) av genet er bekreftet på proteinnivå ved hjelp av vestlig blot, og på funksjonelt nivå ved hjelp av kalsiumavbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Muskelbiopsier ble hentet fra Bank of Tissues for Research (Myobank, en partner i EU-nettverket EuroBioBank, Paris, Frankrike) i samsvar med europeiske anbefalinger og fransk lovgivning. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle individer. Udødelige myoblaster ble vennlig produsert av Dr. V. Mouly (Myology Institute, Paris, Frankrike), og protokollene ble godkjent av Myology Institute ethic committee (MESRI, n AC-2019-3502).

1. CRISPR guide design

  1. Identifiser genets region som skal slettes. Søk etter den genomiske sekvensen ved hjelp av genomleserverktøy som ensembl.org eller genome.ucsc.edu og bestem de kromosomiske koordinatene til de to regionene for å se etter guiden RNA (gRNA), på begge sider av regionen som skal slettes.
    1. For genet som brukes her, få FASTA-sekvensen av RYR1-genet og sekvensen av exon 101 som følger. I ensembl, søk RYR1 i den nyeste versjonen av det menneskelige genom, velg den første oppføringen, og klikk på transkripsjonen av proteinkodingssekvensen. Klikk deretter på Exons for å omdirigere til listen over eksoner av genet.
    2. Klikk på Last ned sekvens og velg Bare genomisk sekvens for å laste ned hele konsensussekvensen til hele genet. Bla nedover listen over eksoner og introner i genet og velg de målrettede(e).
    3. Finn den tilsvarende nukleotidsekvensen i genet. Velg nukleotidsekvensene til intronene umiddelbart oppstrøms og nedstrøms for eksonen som skal slettes, som vil bli brukt til å søke etter gRNAene.
  2. Design de to gRNA, kalt guide 1 og guide 2 her, i regionene identifisert i trinn 1.1 (introns oppstrøms og nedstrøms regionen som skal slettes) ved hjelp av online verktøy som Crispor.tefor.net8. Velg de to gRNAene atskilt med noen få hundre basepar (bp), sekvensen av hver gRNA er nøyaktig 20 nukleotider lang uten protospacer tilstøtende motiv (PAM). Velg de beste veiledningene som er tilgjengelige for å begrense off-target. Se figur 1 for et eksempel på veiledningsutforming.
    1. Sekvensen mellom de to guidene forventes å bli slettet, og for å resultere i utslag av genet av interesse, og dermed velge posisjonen til de to guidene slik at den sletter en viktig sekvens eller en viktig exon i genet av interesse. Forsikre deg om at den slettede sekvensen / eksonen ikke er til stede utelukkende i en alternativ transkripsjon av genet og / eller at det koder en viktig del av proteinet, og dermed vil slettingen resultere i en funksjonell knock-out.
      MERK: Selv om Cas9-spaltningsstedet er spådd å forekomme 3 bp oppstrøms for protospacer tilstøtende motiv (PAM), kan spalting i større avstand også forekomme, og dermed er en god løsning ikke å avhenge av nøyaktig lokalisering av spaltningsstedet, for eksempel spalting i intron.
  3. Bestem den omvendte komplementsekvensen (RC) for hver gRNA, uten PAM, for å ha følgende sekvenser: Guide 1 og Guide 1-RC, Guide 2 og Guide 2-RC.
  4. Bestill primerne som presenteres i tabell 1 for å utføre kloning av plasmidene. Gjennom hele protokollen, bruk primere i en konsentrasjon på 10 nM i steril H2O.
    MERK: Sekvensene som legges til gRNAene i disse primerne (fet og understreket) tilsvarer sekvensen av plasmidet før og etter guiden, promotoriske og transaktiverende Crispr RNA (tracrRNA), henholdsvis og bør ikke endres for å sikre en god overlapping mellom primerne og plasmidet.

2. Plasmid kloning

MERK: I dette trinnet vil gRNAene settes inn i plasmid ryggraden for lentivirusproduksjon. En kassettkoding av de to gRNAene produseres først av påfølgende polymerasekjedereaksjoner (PCR), ved hjelp av de overlappende primerne. Den nye kassetten settes deretter inn i lentiviral ryggradsplasmid #87919.

  1. Få følgende plasmider: plasmid #87919, koding for CRISPR guide RNAer i en lentiviral vektor og plasmid # 87904 koding for SpCas9-sekvensen i en lentiviral vektor.
  2. Kassett konstruksjon
    MERK: Kloningsprotokollen er oppsummert i Figur 2.
    1. Kjør en PCR (A)-reaksjon, med 2 μL plasmid #87919, 2 μL primer_XmaIF, 2 μL primer_Guide1R, 25 μL polymeraseblanding og 19 μL H2O. Kjør følgende PCR-program (program 1): innledende denaturering 5 min ved 98 °C, etterfulgt av 30 sykluser på: 30 s ved 98 °C, 30 s ved 60 °C, 1 min 45 s ved 72 °C og en endelig forlengelse på 7 min ved 72 °C. Tm av primerne beskrevet i trinn 1.4 er 60 °C.
      MERK: Selv om forlengelsestiden i program 1 virker ganske lang, er denne forlengelsestiden valgt for å sikre produksjon av nok materiale av riktig størrelse. Faktisk, på grunn av de gjentatte sekvensene i plasmidet (sekvensen av tracrRNA etter RNA-guider gjentas tre ganger i plasmid #87919) er PCR-forsterkningen av det forventede DNA vanskelig, og ytterligere mindre bånd produseres i de påfølgende PCR-ene. På grunn av konkurransen mellom de forskjellige PCR-produktene har enten forlengelsestiden blitt økt (for å favorisere den lengste og for å ha nok renset materiale på slutten), eller en touch down PCR (program 2) har blitt brukt til det lange fragmentet (som beskrevet for PCR (endelig) i trinn 2.2.6).
    2. Skill PCR-produktene på en 1% agarose gel i Tris-Borate-EDTA buffer (TBE), slukk og rens 300 bp fragmentet. Utfør rensing ved hjelp av et dedikert sett etter produsentens instruksjon, med elution i et sluttvolum på 20 μL. Bruk enten det rensede fragmentet direkte eller oppbevar ved -20 °C i trinn 2.2.5.
    3. Kjør en PCR (B)-reaksjon, med 2 μL plasmid #87919, 2 μL primer_Guide1F, 2 μL primer_Guide2R, 25 μL polymeraseblanding og 19 μL H2O ved hjelp av PCR-programmet 1. Skill PCR-produktene på en 1% agarose gel i TBE, sluk og rens 400 bp fragmentet i 20 μL elutionbuffer. Bruk enten det rensede fragmentet direkte eller oppbevar det ved -20 °C i trinn 2.2.5.
    4. Kjør en PCR (C)-reaksjon, med 2 μL plasmid #87919, 2 μL primer_Guide2F, 2 μL primer_BlpIR, 25 μL polymeraseblanding og 19 μL H2O ved hjelp av PCR-program 1. Skill PCR-produktene på en 1% agarose gel i TBE buffer. Slukk og rens fragmentet på 600 bp i 20 μL elutionbuffer. Bruk enten det rensede fragmentet direkte eller oppbevar det ved -20 °C i trinn 2.2.6.
      MERK: Et annet fragment på 900 bp kan være synlig, på grunn av hybridisering av primeren på de gjentatte områdene i plasmidet, som beskrevet i MERKNAD i trinn 2.2.1. Hvis det finnes, bør dette båndet kastes.
    5. Kjør en PCR (D)-reaksjon, med 2 μL elution PCR A (fra trinn 2.2.2), 2 μL elution PCR B (fra trinn 2.2.3), 2 μL primer_XmaIF, 2 μL primer_Guide2R, 25 μL polymeraseblanding og 19 μL H2O, med PCR-program 1. Skill PCR-produktene på en 1% agarose gel i TBE buffer; særskilt og rense 700 bp fragmentet i 20 μL elutionbuffer. Bruk enten det rensede fragmentet direkte eller oppbevar det ved -20 °C i trinn 2.2.6.
      MERK: Andre bånd kan være synlige ved >1000 bp, 400 bp og 300 bp, på grunn av hybridisering av primerne på de gjentatte regionene og bør kastes.
    6. Kjør en PCR (endelig) reaksjon, med 4 μL elution PCR C (fra trinn 2.2.4), 4 μL elution PCR D (fra trinn 2.2.5), 4 μL primer_XmaIF, 4 μL primer_BlpIR, 50 μL polymeraseblanding og 34 μL H2O. Programmet som brukes er følgende (PCR program 2): innledende denaturering i 5 min ved 98 °C; seks sykluser på: 30 s ved 98 °C, 30 s ved 66 °C (reduksjon i hybridiseringstemperatur på 1 °C per syklus), 1 min 45 ved 72 °C; 35 sykluser på: 30 s ved 98 °C, 30 s ved 60 °C, 1 min 45 ved 72 °C og en endelig forlengelse på 5 min ved 72 °C.
      MERK: PCR-programmet for denne endelige forsterkningen er en touch down PCR, forskjellig fra den forrige, på grunn av den store størrelsen på den endelige forsterkningen som inneholder to gjentatte tracrRNA-sekvenser like etter hver guide.
    7. Skill PCR-produktene på en 1% agarose gel i TBE buffer; og rense den endelige kassetten, som migrerer til ca. 1300 bp i 20 μL elutionbuffer. Kvantifisere det eluterte produktet. Bruk enten det rensede fragmentet direkte eller oppbevar det ved -20 °C i trinn 2.3.2.1. Dette er sluttproduktet som skal settes inn i lentiviral plasmid.
      MERK: Andre fragmenter kan være synlige ved >1000 bp, 400 bp og 300 bp, tilsvarende ufullstendige PCR-fragmenter som skal kastes.
  3. Innsetting av gRNAs kassett i lentiviral plasmid ryggrad.
    1. Lineariser plasmidet ved dobbel fordøyelse av plasmid #87919 med begrensningsenzymene XmaI og BlpI.
      1. Forbered reaksjonen med 15 μL anbefalt buffer, 15 μL plasmid (1μg/μL), 7,5 μL BlpI-enzym (ved 10 U/μL), 7,5 μL XmaI-enzym (ved 10 U/μL) og 112,5 μL H2O. Inkuber i 1 time ved 37 °C, og deretter i 20 minutter ved 65 °C. Last den totale mengden på en 1% agarose gel, kutt ut og rens ~ 10 kb plasmid med et passende sett. Elution utføres i 20 μL buffer, og det eluterte produktet kvantifiseres ved hjelp av optisk tetthetsmåling.
        MERK: Bruk en passende renseprotokoll for stort DNA-fragment, for eksempel protokollen beskrevet av Sun og coll9.
    2. Ligate gRNA-kassetten og plasmiden. Forbered reaksjonsblandingen med gRNA-kassett fra trinn 2.2.7 og den lineariserte plasmiden fra trinn 2.3.1.1, tilsett 2 μL enzym og H2O for å ha et sluttvolum på 10 μL. Inkuber i 15 min ved 50 °C for å produsere den endelige plasmiden kalt p_guides.
      MERK: DNA-kassettmengden skal være mellom 50-100 ng og plasmid mengde mellom 100-200 ng, med et 2:1 molarforhold.
  4. Bruk 2 μL av den nylagde plasmiden til å transformere kjemisk kompetent E.Coli som Stbl3 (50 μL) eller XL10-Gold og spred på LB agarplate med 100 μg/ml ampicillin etter 1 t vekst ved 37 °C uten antibiotika. Inkuber ved 37 °C over natten. Velg noen kolonier og utfør en mini prep ved hjelp av et kommersielt sett i henhold til produsentens instruksjoner.
  5. Utfør en PCR-forsterkning på miniprep-DNA-et med Primer_XmaI og Primer_BlpR ved hjelp av PCR-program 1 (se figur 2). Skill PCR-produktene på en 1% agarose gel i TBE buffer. Velg noen kolonier (~5) med et bånd med en forventet størrelse på ca. 1300 bp.
  6. Utfør DNA-sekvensering av de valgte koloniene, ved hjelp av Primer_XmaI eller Primer_BlpR, for å bekrefte riktig innsetting av gRNA-kassetten.
    MERK: En av de sekvensbekreftede koloniene brukes videre i studien, og plasmidet kalles p_guides.
  7. Gjenta fra trinn 2.2 (kassettkonstruksjon) med Primers-Killer F og R, og Primers-mCherry F og R. Bruk en sekvensbekreftet koloni for videre analyse. Plasmiden kalles p_Killer.

3. Produksjon av lentivirus

  1. Produser og rens en stor mengde av alle nødvendige plasmider ved hjelp av et endotoksinfritt maxi-prep-sett i henhold til produsentens instruksjoner. Forbered aliquots ved 2 μg/μL. Oppbevares ved -20 °C
  2. Forberedelse av celler (dag 1)
    1. Forbered 18 plater med 145 cm frø med 1 x 106 HEK293 celler per plate i 16 ml medium sammensatt av Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) høy glukosepyuvatt, supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin. Forsterk cellene ved 37 °C, i en 5 % CO 2-inkubator i 3 dager.
      MERK: Produksjon av lentivirus må utføres med forsiktighet i et Biosafety Level 2-laboratorium, ved hjelp av tilpassede beskyttelsesgir, inkludert engangs beskyttelsesdrakt, beskyttelseshette og hansker. Alle forsøkene må gjøres under en laminær strømningshette (BSLII sikkerhetsskap) med filterspisser. Alle oppløsninger som inneholder lentivirus og alt brukt plast-/glassavfall må inaktiveres med etanol 70 % eller annen virusinaktivator.
  3. Transfeksjon av celler (dag 4)
    1. Kontroller sammenløpet av cellene, for å være sikker på at de har nådd 60% -65% samløp.
    2. Forbered transfeksjonsløsningen som inneholder for hver plate: 20,8 μg av interesseplasmiden (p-guider, p-Killer eller pCas9 #87904), 4,8 μg av plasmidkodingen av konvolutten (VSV-G, #8454), 20,8 μg av plasmid psPAX2 (#12260) for lentiviral emballasje, 136 μL kalsiumfosfat og juster med H2O til et sluttvolum på 1000 μL. Tilsett denne løsningen dropwise og under agitasjon til 1 ml 2x HEPES-bufret saltvann (HBS).
      MERK: Ikke lag en blanding for alle platene samtidig for å sikre optimal tilberedning av reagenser; Lag en blanding for seks plater samtidig, for eksempel for 18 plater, lag tre ganger en blanding for seks plater.
    3. Inkuber ved romtemperatur (RT) i minst 10 min og tilsett 2 ml løsning dråpevis til cellene. Homogeniser transfeksjonsreagensen med mild agitasjon av platen bakover, fremover, opp og ned, inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i minst 5 timer.
      MERK: Fra dette punktet og til slutten av produksjonen av lentivirus, bruk ekstra beskyttelsesutstyr, inkludert et annet par hansker, beskyttelseshylser og en engangsgips.
    4. Fem timer etter transfeksjonen, fjern mediet fra platene og skyll med PBS for å kvitte seg med transfeksjonsreagenser. Tilsett 12 ml friskt medium og inkuber 48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
  4. Innsamling av viruspartikler (dag 6)
    1. Samle og basseng mediet fra alle platene. Sentrifuge ved 800 x g i 5 min ved 4 °C, til pelletscelleavfall. Filtrer supernatanten ved hjelp av et filter på 0,45 μm (flere filtre kreves).
    2. Sentrifuge ved 68 300 x g i 2 timer ved 4 °C i en svingende bøtterotor. Fjern supernatanten og la rørene opp ned under sikkerhetsskapet på et papir i 5-10 min for å fjerne så mye væske som mulig, og tilsett deretter 100 μL HEK-spredningsmedium per pellets. Etter minst 2 timer ved 4 °C, resuspender pellets ved pipettering opp og ned. Basseng alle resuspended pellets.
      MERK: Pellets kan etterlates i mediet over natten ved 4 °C før aliquoting.
    3. Aliquot lentivirus i 10 μL eller 25 μL prøvestørrelse (avhengig av bruk) og snap-freeze med flytende nitrogen. Oppbevars ved -80 °C. Ikke frys en aliquot som er tint.
  5. Gjenta trinn 3.2 til 3.4 med andre plasmider av interesse for å produsere LV-guider, LV-Killer og LV-Cas9.
    MERK: Som et alternativ kan lentivirusene kjøpes fra et selskap eller et virusanlegg.

4. Lentivirustitrering

MERK: Virustitrering utføres på HEK293-celler. Titreringen er viktig å innlemme i de påfølgende trinnene et presist antall lentivirus per celle (uansett batch av lentivirus), for cellene av interesse. Antall virale partikler som effektivt transduserer en celle kalles multiplisiteten av infeksjon (MOI): MOI 10 tilsvarer dermed innføringen av 10 viruspartikler per celle. Ettersom fryse-/tiningssyklusen påvirker levedyktigheten til lentiviruset, utføres titreringen med en frossen lentivirus aliquot, og hvert påfølgende eksperiment vil bli utført med en ny aliquot av samme basseng. En titreringsmetode er beskrevet her, men andre metoder kan brukes.

  1. På dag 1 frø 1 x 105 celler per plate i fem 35 mm plater med glassdeksler på bunnen og to 35 mm plater uten deksler.
  2. På dag 2, fra de to platene uten deksler, samle og telle antall celler etter trypsinisering, og bestemme gjennomsnittlig mengde celler per plate (N).
  3. Forbered 100 μL lentivirus fortynnet ved 1/10 i spredningsmedium. Transduser de fem dyrkede platene med forskjellige mengder fortynnet virus, fra 1 til 50 μL fortynnet virus. For denne protokollen, bruk følgende volumer for å transdusere de fem platene: 1 μL, 5 μL, 10 μL, 20 μL, 50 μL. Inkuber i 48 timer ved 37 °C, i en 5 % CO2.
  4. På dag 4 fikser du cellene ved inkubasjon av dekslene på RT i 20 til 30 minutter i 4% paraformaldehyd. For LV-Cas9, permeabilisere cellene med 0,1% Triton X100 i fosfat buffer saltvann (PBS) i 10 min ved RT, mettet i PBS-0,1% Triton X100-2% geitserum- 0,5% Bovine Serum Albumin (BSA) i 20 min ved RT, og etikett i 45 min ved RT med primær antistoff anti-V5 (fortynning 1/400) etterfulgt av 30 min inkubasjon ved RT med fluorescerende sekundært antistoff. Merk kjernene med Hoescht (10 μg/ml i PBS) i 10 minutter ved RT.
  5. Monter dekslene på en sklie og observer ved hjelp av et fluorescerende mikroskop utstyrt med et 20x mål. For LV-guider og LV-Killer, etter fiksering fortsett direkte til nuklei merking og montere dekslenelips. For hver coverlip teller du det totale antallet kjerner (totalt antall celler) i synsfeltet og antall celler merket (enten med V5 eller mCherry), og bestemmer forholdet mellom celler merket for hver coverlip.
  6. Velg en coverlip der forholdet mellom transinduserte celler er minst 10% og ikke overstiger 50%. Bestem transduksjonseffektiviteten (X) for denne dekslen, og noter volumet av fortynnet virus (V, i μL) som brukes til å oppnå denne transduksjonseffektiviteten.
    Equation 1
  7. Bestem titeret (i smittsomme partikler, representert som ip / ml) av viruset i henhold til følgende formel:
    Equation 2
    Fortynningsfaktoren er fortynning av lentiviruset som utføres i trinn 4.3. Vi fikk rutinemessig en endelig titer på 1 x 109 ip / ml for LV-Cas9 og 1 x 1010 ip / ml for LV-guide, bestemt i HEK-celler.

5. Myoblast transduksjon

MERK: De udødelige myoblastene transduseres suksessivt med de tre lentivirusene som tidligere ble produsert. De opprettholdes med en tetthet under 50% i et spredningsmedium som består av Hams F10 supplert med 20% FBS, 2% penicillin/streptomycin, 2% Ultroser G, og dyrket ved 37 °C, 5 % CO2.

  1. Bestem volumet av lentivirus som trengs for å behandle det valgte antall celler med MOI 10 for LV-Cas9 og LV-guider og MOI 20 for LV-killer, i henhold til følgende formel:
    Equation 3
    MERK: I et parallelt eksperiment har transduksjonseffektiviteten blitt sammenlignet på myoblaster og HEK, ved hjelp av et kontroll lentivirus (lenti-GFP), og vi har fastslått at fem ganger flere lentivirus er nødvendig for å transdusere en myoblast effektivt sammenlignet med en HEK-celle. Dermed tilsvarer MOI 10 målt på HEK to virale partikler per myoblast. MOI som brukes her beregnes på HEK-celler.
  2. På dag 1 frø 96-brønns plater med 10.000 celler i 100 μL proliferation medium per brønn. På dag 2, transduser cellene under sikkerhetsskapet ved å legge til riktig volum LV-guider og LV-Cas9 beregnet i trinn 5.1. Returner cellene til inkubatoren til dag 7.
    MERK: Bruk av MOI høyere enn 25, spesielt for LV-Cas9, kan ikke forbedre antall redigerte celler på grunn av høyere celledød ved høy konsentrasjon av lentivirus.
  3. På dag 7 utfører du trypsinisering og teller cellene. Frø cellene med en sammenløp på 40% til 50% i en ny plate og returner cellene til inkubatoren. Fem timer senere, transduser cellene med LV-Killer på en MOI på 20 (volum beregnet i trinn 5.1). Forsterk cellene i 5 til 10 dager etter transfeksjon, i minst to passasjer, og hold dem alltid på en lav sammenløp på <50%. Cellene er klare for neste trinn, cellulær kloning, når veksten er tilbake til normal (estimert av divisjonstiden).
    MERK: Spredningen kan være litt tregere etter transduksjonen. Den normale celleveksten kan bestemmes før denne eksperimentelle prosedyren ved estimering av divisjonstiden til cellene.

6. Cellulær kloning

MERK: Siden myoblasttransduksjon er vanskelig og aldri når 100% effektivitet, selv når du bruker lentivirus, er cellulær kloning nødvendig for å få en fullstendig korrigert cellelinje. Dette er bare mulig med udødelige celler, eller celler som kan dyrkes og forsterkes i løpet av få uker / måneder.

  1. Prøv å telle og telle cellene. Fortynn cellene i spredningsmedium ved 10 celler/ml og frø cellene ved 1 celle/brønn i 96-brønnsplater som inneholder 100 μL/mediumbrønn.
    MERK: Antall plater som skal seedet avhenger av sannsynligheten for forventet genredigering, 2 til 10 plater brukes rutinemessig.
  2. Overvåk cellene for vekst og gradvis forsterke hver brønn i en større plate til de når minst en 35 mm plate, samtidig som samtidigheten av myoblastene under 50%. Dette trinnet kan vare 2-6 uker, avhengig av cellene som brukes og deres evne til å vokse en gang isolert i en brønn.

7. Klone utvalg

MERK: Dette trinnet utføres for å identifisere hvilke av de voksende klonene som er riktig modifisert.

  1. Design et sett med primere som består av en primer som ligger foran den første guiden (Primer_BeforeGuide1F) og en annen primer som ligger etter den andre guiden (Primer_AfterGuide2R) for å forsterke regionen som omslutter den putativt modifiserte sekvensen. Se tabell 1 for primerne som brukes her.
  2. Samle celler fra hver klone, spar minst 300 000 celler for fremtidig forsterkning, og trekk ut genomisk DNA ved hjelp av en hvilken som helst standardprotokoll på de gjenværende cellene.
    1. Hvis et stort antall kloner vokser, for å kaste de ikke-redigerte, utfør en rask test ved å samle celler fra fem kloner i samme rør for å trekke ut DNA fra dette bassenget og teste med PCR. Gjenta med så mange kloner som nødvendig. Deretter skiller du bassengene som inneholdt redigerte celler, ytterligere for å utføre individuelle analyser.
  3. Kontroller redigeringen av PCR som følger. Forbered PCR-reaksjonen med 1 μL Primer_BeforeGuide1F, 1 μL Primer_AfterGuide2R, 12,5 μL polymeraseblanding, 3 μL genomisk DNA og 7,5 μL H2O. Amplify i en termocycler i henhold til produsentens instruksjoner og primerparametere. Kjør på en 1% agarose gel for å identifisere de redigerte klonene.
  4. Kontroller redigeringen ved å sekvensere på følgende måte. Utfør Sanger-sekvensering av de valgte klonene for å bekrefte slettingen og for å identifisere hvordan redigeringen er utført i hver klone. Hold mer enn én redigert klone for å sikre at bare det målrettede genet er modifisert og er ansvarlig for den fysiologiske effekten som observeres, og behold en ikke-redigert klone som vil bli brukt som kontrollklone (CTRL) i de påfølgende eksperimentene.
  5. Utvide de merkede klonene. Når sammenløpet av hver klone har nådd ca 50%, trypsinize cellene og plate cellene i en større tallerken, til nok celler har blitt produsert for å utføre biokjemiske og funksjonelle karakteriseringer (vanligvis mer enn 1 x 106 per klone), og lagre frosne aliquots av hver klone for fremtidig bruk.

8. Karakterisering av redigerte kloner

MERK: Når noen få kloner er plukket og bekreftet ved DNA-sekvensering, kan slettingen av det målrettede genet bekreftes på proteinnivå ved hjelp av vestlig blot, og på funksjonelt nivå hvis en funksjonell cellulær analyse er tilgjengelig for dette genet. Når det gjelder RYR1-KO, da RyR1 er en kalsiumkanal, har den funksjonelle karakteriseringen blitt utført ved hjelp av kalsiumavbildning på dyrkede celler.

  1. Proteinuttrykk i redigerte kloner
    MERK: RyR1 uttrykkes kun i differensierte myotuber10. Uttrykket har blitt evaluert i myotubes ved hjelp av vestlig blot, for å bekrefte slettingen på proteinnivået til RyR1, samt sletting av Cas9-proteinet.
    1. Plate 200.000 celler i proliferation medium (beskrevet ovenfor, trinn 5) på en overflate på ca 1,76 cm2 i en 35 mm plate belagt med laminin (overflate tilsvarende en 200 μL dråpe laminin ved 10 mg / ml i PBS med kalsium). Når cellene sitter fast på platen etter å ha blitt inkubert i 2-3 timer ved 37 °C, 5 % CO2, skifter du kulturmediet til et differensieringsmedium som består av DMEM lav glukose + 10 % hesteserum + 1 % penicillin/streptomycin, og returnerer cellene til inkubatoren i 6 dager.
    2. Etter 6 dager med differensiering, samle og lyse cellene med 200 μL RIPA supplert med proteasehemmere. Bestem proteinkonsentrasjon ved hjelp av Folin Lowry-metoden11.
    3. Last 15 μg protein, etter denaturering i 30 min ved RT i Laemmli denaturation buffer, på en 5%-15% gradient akrylamid gel. Etter elektroforetisk separasjon, overfør proteinene på Immobilon P ved 0,8 V i 4 t11.
    4. Etter metning av membranen i 30 min ved RT i PBS som inneholder 0,1% Tween 20 og 5% ikke-fett tørr melk, Inkuber membranen med de primære antistoffene fortynnet i samme buffer i 2 timer ved RT eller over natten ved 4 °C, vask membranen 5x i 5 min med PBS-0,1% Tween 20 og inkuber membranen med sekundære antistoffer i 1 time ved RT. De primære antistoffene som brukes er: antistoffer mot V5-tag (fortynning: 1/5000) for å oppdage Cas9, anti-GAPDH (fortynning: 1/1000) som en lastkontroll, anti-RyR1 antistoff12,13 (fortynning: 1/10.000), antistoff mot alfa 1 underenhet av DHPR (fortynning: 1/1000) og antistoff mot myosin tungt kjede MF20 (fortynning: 1/1000).
    5. Vask membranen 5x i 5 min med PBS-0,1% Tween 20, tørk overflødig væske og tilsett chemiluminescent substratet. Fortsett som anbefalt av substratleverandøren for å oppdage chemiluminescent signalet.
  2. Funksjonell karakterisering av redigerte kloner
    MERK: Funksjonen til RyR1 ble vurdert ved hjelp av kalsiumavbildning i differensierte myotuber, produsert fra CTRL- eller KO-kloner14.
    1. Plate 50.000 celler på en 0,2 cm2 overflate i midten av 35 mm retter belagt med laminin (overflate dekket av en 50 μL laminindråpe, ved 10 mg / ml i PBS med kalsium) og induser differensiering i 6 dager som beskrevet i trinn 8.1.1. Forbered tre plater for hver stimulering, for å ha et biologisk triplikat.
    2. Last myotubene med 50 μL fluo 4-direkte, fortynnet 1:1 i differensieringsmedium og inkubert i 30 min ved 37 °C. Skyll cellene to ganger med KREBS-buffer supplert med glukose ved 1 mg/ml.
    3. Mål fluorescensvariasjonene med et invertert fluorescerende mikroskop eller et konfokalt mikroskop ved hjelp av et 10x mål. Monter platen på scenen av mikroskopet og start oppkjøpet på 1 ramme per sekund i 90 s.
    4. Fjern de resterende KREBS og stimulere cellene ved ramme 25 ved tilsetning av 2 ml KCl for membrandepolarisering (140 mM endelig konsentrasjon) eller 2 ml 4 cmC (500 μM endelig konsentrasjon) for RyR1 direkte stimulering. Sørg for at minst 10 myotuber er til stede i feltet som er registrert.
    5. Kvantifisere fluorescensvariasjonen i hver myotube, ved hjelp av en dedikert programvare. Velg for analyse minst 10 myotuber per tallerken (ideelt 20-30 myotubes per tallerken), tegn en linje (eller en region av interesse (ROI)) på den lange aksen på hver myotube og samle fluorescens F langs denne linjen for alle rammene.
    6. Bestem den opprinnelige fluorescerende verdien, F0, som tilsvarer ramme 1 til 24. Plott den fluorescerende variasjonen (F-F0)/F0 som en funksjon av tid fra 0 til 90 s. Gjenta eksperimentet tre ganger for å oppnå fluorescensvariasjonen fra minst 90 myotuber fra tre forskjellige kulturer. Samle alle resultatene for de 90 myotubene og beregn gjennomsnittet ± SEM av (F-F0)/F0 ved hver tidsramme. Kvantifisere toppamplituden av kalsiumfrigjøring for hver stimulering og hver klone.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen ble brukt på udødeliggjorte myoblaster fra et sunt emne15 (såkalte HM-celler, for menneskelige myoblaster), der RyR1 tidligere har blitt karakterisert16, for å slå ut RYR1-genet som koder RyR1-proteinet. Utformingen av guidene RNA ble laget for å slette sekvensen som omfatter en del av exon 101 og intron 101 av genet. Sletting av deler av exon 101 forutsettes å føre til forstyrrelser i leserammen. I tillegg koder exon 101 poren av proteinet og er dermed nødvendig for å produsere en funksjonell kalsiumkanal. Mange pasienter som er rammet av en alvorlig RyR1-relatert myopati har en mutasjon i denne regionen avgenet 7. De beste guidene som ble spådd med Crispor-programvare ble valgt for å ha så få off-targets som mulig, samtidig som de holdt den beste effektiviteten. Vi valgte å bruke to guider samtidig i samme virale vektor, for å sikre at en stor del av cellene blir knock-out, og for å lette påvisning av slettingen i redigerte kloner ved hjelp av PCR. De to valgte støttelinjene (se tabell 2 og figur 1) er lokalisert henholdsvis på slutten av exon 101 og i begynnelsen av intron 101, noe som resulterer i en sletting på 326 bp og en påfølgende frameshift. Dette sikrer at de redigerte cellene blir RYR1-KO.

GRNA rettet mot SpCas9 var den som allerede var designet av Merienne og kolleger6 og til stede i plasmid #87919 under den svake promotoren 7SK. Ettersom effektiviteten for å målrette SpCas9-sekvensen allerede er demonstrert i studien6, har den blitt brukt til å skape den plasmid p_Killer, men under kontroll av den sterke promotøren H1. Den andre guiden i p_Killer plasmid er designet for å målrette mCherry-sekvensen under promotoren U6. Dette vil tillate sletting av mCherry, noe som kan være forstyrrende i noen påfølgende eksperimenter med den nyopprettede cellelinjen.

Plasmider p_guides og p_killer ble opprettet og alle nødvendige lentivirus ble produsert i det dedikerte BSL2 kulturrommet. Etter myoblasts transduksjon ble cellene dyrket i 2 uker til vekstgjenoppretting og analysert ved hjelp av PCR for å bekrefte tilstedeværelsen av redigerte celler. For cellulær kloning ble to 96-brønnsplater sådd med behandlede celler ved 1 celle per brønn. Cellevekst ble observert i 32% av dyrkede brønner. Genomisk DNA ble deretter hentet ut fra klonene og PCR-analysen ble gjort til to korrigerte kloner ble identifisert (såkalt Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2), se figur 3. Slettingen av den målrettede delen av RYR1 ble bekreftet av Sanger-sekvensering. Det er brukt flere kontrollceller, for eksempel de første HM-cellene, eller HM-celler som behandles med samme prosedyre, men ikke redigeres som bekreftet av PCR og sekvensering (Cl-CTRL). Utvalgte kloner ble deretter forsterket og ytterligere karakterisert på proteinnivå og funksjonsnivå.

For å validere fullstendig utryddelse av RyR1 og Cas9 på proteinnivå, ble vestlig blotanalyse utført. Resultatene presenteres på figur 4. Cas9-proteinet, fraværende i HM-cellene, ble oppdaget 5 dager etter transduksjonen av cellene med LV-Cas9 (HM +LV-Cas9), og som forventet ble uttrykket avskaffet i Cl-CTRL og i den redigerte Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2, selv om en liten mengde Cas9 fortsatt ble oppdaget i Cl-KOR-2 (figur 3A). Ettersom gRNA-målrettingen Cas9 fortsatt uttrykkes, forventes mengden gjenværende Cas9 å forsvinne gradvis. Uttrykket av andre viktige proteiner ble også vurdert ved hjelp av vestlig blot: RyR1, for å bekrefte full sletting av proteinet, alfa1-underenheten til DHPR, som er den funksjonelle partneren til RyR1 involvert i eksitasjonskontraksjonskobling, og myosintunge kjeden som en markør for differensiering, fordi RyR1 og DHPR uttrykkes bare i differensierte myorør (figur 3B ). DHPR og MYHC skal ikke endres. Selv om den vestlige blotten bekreftet fullstendig sletting av RyR1 i de to RyR1-KO-klonene (Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2), kan ytterligere modifikasjoner som følge av Cas9 eller fra kloningsprosedyren ha skjedd i Cl-KOR-2, som i tillegg presenterte et fravær av DHPR og en reduksjon i myosin tung kjede (MHC). Siden begge proteinene bare uttrykkes i differensierte myotuber, gjenspeiler deres fravær sannsynligvis endring i differensiering, noe som muligens kan stamme fra den lange enkeltcellekloningsprosedyren forbundet med en lokal overvekst av cellene som fører til de tapte i deres myogene potensial. Dermed er det bare Cl-KOR-1 som har blitt ytterligere karakterisert på funksjonsnivå. Dette viser at valg av mange redigerte kloner er viktig for å kunne jobbe med de beste.

Den funksjonelle karakteriseringen ble utført ved hjelp av kalsiumavbildning. Gjennomsnittlig fluorescensvariasjon som tidsfunksjon er representert på figur 5, på minst 180 myotuber av hver genotype, ved hjelp av enten en direkte RyR1-stimulering ved 4 CMC eller stimulering av kalsiumutløsningskomplekset (DHPR forbundet med RyR1) ved KCl-membrandepolarisering.

Disse eksperimentene viste at den ikke-modifiserte Cl-CTRL hadde en oppførsel som kan sammenlignes med den første cellepopulasjonen (HM-celler) og reagerte på direkte RyR1-stimulering av aktivatoren 4-CmC og ved stimulering av kalsiumutløsningskomplekset ved membrandepolarisering. Den redigerte Cl-KOR-1 kunne derimot ikke svare på noen av stimuleringene (4 cmC og KCl-depolarisering), som forventet for en RyR1-KO.

Til sammen bekreftet den vestlige blokken og den funksjonelle karakteriseringen at Cl-KOR-1-cellelinjen er en RyR1-KO muskelcellelinje. Denne protokollen kan brukes på et hvilket som helst annet gen uttrykt i skjelettmuskulatur, eller annen celletype (for eksempel induserte pluripotente stamceller - iPSC). Hele protokollen er illustrert i figur 6.

Figure 1
Figur 1: Lokalisering og utforming av guidene RNA. (A) Skjematisk lokalisering av veiledningene designet for opprettelsen av RYR1-KO-cellelinjen. Guide 1 retter seg mot slutten av exon 101 i RYR1-genet , Guide 2 retter seg mot intron 101, og skaper en sletting på 326 bp og en frameshift. Guide Killer retter seg mot initiering codon i sekvensen av SpCas9, Guide mCherry mål slutten av mCherry sekvensen. (B) Lokalisering av guidene i genomsekvensene for den tidligere beskrevne Guide 1, Guide 2, Guide killer og Guide mCherry. Sekvensen til hver guide (20 bp i lengde) presenteres i farge og PAM for hver guide er fet og understreket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kloningsprosedyre for produksjon av kassetten. Skjematisk presentasjon av de forskjellige PCR utført for å produsere kassettene med guidene, som skal settes inn i lentivirusets ryggradsplasmid. PCR A, PCR B, PCR C og PCR D realiseres med program 1 illustrert på høyre topp, og PCR-finalen med PCR-programmet 2, illustrert nederst til høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Valg av kloner ved hjelp av PCR. (A) Skjematisk presentasjon av PCR-forsterkning av en 1200 bp-region som omfatter støttelinjene, med fremre og omvendte primere representert av de grå pilene. DNA-spalting ved begge guidene forventes å resultere i reduksjon på 326 bp i størrelsen på PCR-fragmentet, som avbildet av de prikkete grønne vertikale linjene under saksen. (B) PCR-produkter produsert fra HM-celler, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2 ble lastet på en 1% agarose gel. DNA-et til HM og Cl-CTRL vises ikke modifisert (full lengde), mens DNA-et til Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2 er kortere enn kontrollen, som forventet (spaltet). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Karakterisering av cellene på proteinnivå. (A) Vestlig blotanalyse for tilstedeværelsen av Cas 9-protein ved hjelp av V5-koden i HM-celler, HM-celler transdusert med LV-Cas9, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2. Cas9 er tydelig oppdaget i HM celler transduced med LV-Cas9, mens uttrykket har blitt avskaffet helt (i Cl-CTRL og Cl-KOR-1) eller nesten helt (i Cl-KOR-2) av LV-Killer. (B) Uttrykk for RyR1, Myosin heavy chain (MYHC), alpha1 subenhet av DHPR og GAPDH som en lastekontroll i Cl-CTRL, Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Funksjonell karakterisering av cellene. Fluo-4 kalsiumavbildning utført på myotuber produsert av HM-celler, Cl-CTRL og Cl-KOR-1. Kurvene representerer fluorescensvariasjonen i HM myotubes (svarte kurver), Cl-CTRL myotubes (grå kurver) eller Cl-KOR-1 (grønne kurver). Alle verdier presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnitt (SEM) av n myotubes. I hver tilstand har n = 180 til 256 myotuber blitt analysert, fra minst tre forskjellige eksperimenter (eksakt tall angitt for hver kurve). 4 CmC (500 μM) ble brukt til å stimulere RyR1 direkte i nærvær av 2 mM eksternt kalsium. KCl depolarisering (140 mM) ble indusert i nærvær av 2 mM eksternt kalsium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Skjematisk presentasjon av hele protokollen. De forskjellige trinnene i protokollen presenteres, fra in silico design til in vitro molekylær kloning og det endelige cellevalget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Navn Sekvens 5'-3' Formål/bruk
Primer_Guide1F Guide1 + gttttagagctagaaatagc Plasmid kloning
Primer_Guide1R Veiledning 1-RC +AGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_Guide 2F Guide 2 + gttttagagctagaaatagc
Primer_Guide 2R Guide 2-RC + GTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_XmaI F TAGTGGATCCCCCGGGAAAATTCAAAATTTT Plasmider kloning og kolonier kontroll
Primer_BlpI R CGCTTCCATTGCTCAGCTGGCCGCTGCCCC
Primer_KillerF AATGGAGTACTTCTTGTCCAgtttagagctagaaatagc Kloning av plasmid p_Killer
Primer_KillerR TGGACAAGAAGTACTCCATTAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_mCherryF GAACAGTACGAACGCGCCGAgttttagagctagaaatagc
Primer_mCherryR TCGGCGCGTTCGTACTGTTCGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_RYR1exonF GCTCGTATTCGTCACCCGCGgtttagagctagaaatagc Kloning av plasmid p_guides_RyR1
Primer_RYR1exonR CGCGGGTGACGACGAGCAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_RYR1intronF TAAGTCAGTTCATAGGCGCTgtttagagctagaaatagc
Primer_RYR1intronR AGCGCCTATGAACTGACTTAGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_BeforeRYR1cut AGTCGTTACCATGTCTTCAGCCCT Klonevalg for RYR1 KO
Primer_AfterRYR1cut CTGCCGATTCCACAGATGAAGCAC

Tabell 1: Liste over primere. Primere som brukes til plasmid kloning og kolonikontroll, samt de for klonevalget.

Navn Sekvens for TV-guide Pam Omvendt komplement uten PAM
Veiledning 1: RYR1exon GCTCGTATTCGTCACCCGCG GGG CGCGGGTGACGAATACGAGC
Veiledning 2: RYR1intron TAAGTCAGTTCATAGGCGCT CGG AGCGCCTATGAACTGACTTA
Guide Killer Cas9 TGGACAAGAAGTACTCCATT GGG AATGGAGTACTTCTTGTCCA
Guide mCherry morder GAACAGTACGAACGCGCCGA GGG TCGGCGCGTTCGTACTGTTC

Tabell 2: Guider som brukes til å lage plasmid p_guides og p_Killer. Sekvensene som brukes til utvikling av RyR1-KO klonene er presentert i denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et viktig skritt på vei til karakterisering av gener av ukjent funksjon involvert i patologier er utviklingen av relevante cellulære modeller for å studere funksjonen til disse genene. Bruken av genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er et eksponentielt voksende forskningsfelt, og utviklingen av knock-out modeller som presenteres her er blant de mest brukte applikasjonene. I denne sammenhengen foreslår vi her en allsidig protokoll for å utvikle en menneskelig cellelinje knock-out i ethvert gen av interesse, slik at karakteriseringen av dette genet i en relevant menneskelig cellemodell. Protokollen som presenteres her kan brukes i udødeliggjorte myoblaster så vel som i iPSC, og kan dermed praktisk talt resultere i produksjon av enhver menneskelig cellemodell KO i genet av interesse.

Begrensningen er at denne protokollen skal brukes på udødelige celler, så mange uker med dyrking samt en cellulær kloning kreves sammen med mange påfølgende forsterkninger. Alternativt bør celler, som kan forsterkes og vedlikeholdes i noen uker eller måneder, brukes. Ved hjelp av denne prosedyren har menneskelig udødeliggjort muskelcellelinje KO for genet av interesse (her RYR1-genet ) blitt produsert i ca 3-4 måneder (unntatt funksjonell karakterisering av cellene).

Denne strategien er egnet for vanskelige å transfektere celler, for eksempel muskelceller, da den er avhengig av bruk av lentivirus for å introdusere alle verktøyene i målcellene, og den er dermed kraftigere enn andre metoder som transfeksjon eller elektroporasjon. Den største ulempen er integrasjon i vertsgenomet, og et mulig alternativ for å unngå skadelig integrering av lentivirus i vertsgenomet er bruken på ikke-integrativt lentivirus17, men effektiviteten til disse ikke-integrative lentivirale partiklene bør være minst lik det vanlige lentiviruset.

Integrasjonssiden kan sannsynligvis påvirke uttrykksnivået til Cas9, men dette er sannsynligvis ikke ansvarlig for den lille mengden Cas9 i Cl-KOR 2. Den lille mengden Cas9 er mest sannsynlig relatert til transduksjonen av denne spesifikke klonen med LV-Killer, som kunne ha vært lavere enn i den andre klonen, eller alternativt kunne antall LV-Cas9 ha vært høyere.

Det anbefales ikke å uttrykke Cas9 alene uten gRNA i lang tid (for eksempel for utvikling av en Cas9-klone), da dette har blitt beskrevet for å øke off-targets, og det kan også øke dødeligheten av cellene.

Vi har valgt å bruke SpCas9 som kjerne, fordi den er mye brukt, den har en kort PAM, og tilbyr derfor flere alternativer for valg av guide RNAer. I tillegg er størrelsen kompatibel med produksjon av lentivirale vektorer. Andre kjerner kan brukes hvis en bestemt PAM må målrettes (for eksempel SaCas9 eller Cpf1)18.

De forskjellige lentivirusene kan produseres i et vanlig BSL2 kulturrom19 eller kjøpes fra et virusproduksjonsanlegg eller et selskap. Kravet om å implementere denne protokollen er kompetanse innen molekylærbiologi og molekylær kloning, og i kultivering av den valgte cellemodellen.

Lentivirusene som koder de forskjellige guidene koder også det fluorescerende proteinet, mCherry. Dette fluorescerende proteinet kan være nyttig, slik at automatisert sortering av cellene og kloning av FACS i stedet for enkeltcellekloning, og i dette tilfellet bør uttrykket av mCherry ikke undertrykkes med LV-morderen. Hvis mCherry skal opprettholdes, bør den andre guiden mot mCherry ikke klones inn i p-morderen (trinn 2.7). For RYR1-genet , som den funksjonelle karakteriseringen gjør bruk av fluorescerende sonder, og fremtidig bruk av denne cellelinjen også kan kreve immunolabeling med fluorescerende antistoffer, har vi valgt å undertrykke mCherry uttrykk. I LV-morderen har gRNA-målrettingen Cas9 blitt plassert under en sterk promotorisk H1 i stedet for den svake promotor 7SK som opprinnelig var til stede i den opprinnelige plasmiden, for å sikre en lignende effektivitet av kjernen på alle de valgte gRNAene, og for å øke Cas9-spaltingen når LV-morderen er lagt til cellene.

Det lengste og mest anstrengende trinnet er kloning av enkeltceller. I vår prosedyre viste muskelcellene en redusert vekst etter lentiviral transduksjon med Cas9 og gjenopprettet etter noen uker. Hvis enkeltcellekloning utføres for tidlig etter virale transduksjoner, sannsynligvis på grunn av massiv celledød, vil bare noen få brønner av en 96-brønnsplate inneholde voksende celler. Dermed er det bedre å forsterke cellene før kloning, og vent på minst 2-3 splitting. Det er også mulig å klone cellene ved 10 celler / vel hvis de ikke vokser godt som enkeltceller. I tillegg bør myoblastene alltid dyrkes med en sammenheng under 50% for å opprettholde en god differensieringsevne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) og fra Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CACNA1S antibody Sigma-Aldrich HPA048892 Primary antibody
Blp I NE BioLabs R0585S Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit Takara 631312  Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG GeneTex GTX221667-01 HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG GeneTex GTX221666 HRP secondary antibody
Fluo-4 direct Molecular Probes F10472 Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb  Cell Signaling Technology #2118 Primary antibody
HindIII Fermentas ER0501 Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus Takara 638920 Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC ThermoFisher Scientific F532L Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody DHSB MF20 Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel REF 740424 Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609 DNA purification
NucleoSpin Tissue Macherey-Nagel 740952 Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli ThermoFisher Scientific C737303 Chemically competent cells
Plasmid #87904 Addgene 87904 Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919 Addgene 87919 Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260 Addgene 12260 Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454 Addgene 8454 Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody Invitrogene R96025  Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 Chemically competent cells
Xma I NE BioLabs R0180S Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
  2. Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
  3. Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
  4. Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
  5. Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
  6. Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
  7. Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
  8. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  9. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  10. Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
  11. Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
  12. Garibaldi, M., et al. Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
  13. Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
  14. Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
  15. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
  16. Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
  17. Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
  18. Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
  19. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).

Tags

Genetikk utgave 184
Utvikling av knock-out muskelcellelinjer ved hjelp av lentivirusmediert CRISPR / Cas9 genredigering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot,… More

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot, A., Halmai, N. B., Segal, D. J., Rendu, J., Marty, I. Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (184), e64114, doi:10.3791/64114 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter