गैर-संक्रामक वायरस से संक्रामक को अलग करने के लिए एपटामर का इन विट्रो चयन
Summary
हम एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसे आम तौर पर चुनिंदा एपटामर पर लागू किया जा सकता है जो केवल संक्रामक वायरस से जुड़ते हैं और उन वायरस ों पर नहीं जो कीटाणुशोधन विधि या किसी अन्य समान वायरस द्वारा गैर-संक्रामक हो गए हैं। यह पोर्टेबल और रैपिड परीक्षणों में संक्रामकता की स्थिति निर्धारित करने की संभावना खोलता है।
Abstract
वायरस संक्रमण का समाज पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है; पता लगाने के अधिकांश तरीकों में यह निर्धारित करने में कठिनाइयां होती हैं कि क्या पता लगाया गया वायरस संक्रामक है, जिससे उपचार में देरी होती है और वायरस का आगे प्रसार होता है। नए सेंसर विकसित करना जो नैदानिक या पर्यावरणीय नमूनों की संक्रामकता पर सूचित कर सकते हैं, इस अपूर्ण चुनौती को पूरा करेंगे। हालांकि, बहुत कम तरीके सेंसिंग अणुओं को प्राप्त कर सकते हैं जो एक बरकरार संक्रामक वायरस को पहचान सकते हैं और इसे उसी वायरस से अलग कर सकते हैं जिसे कीटाणुशोधन विधियों द्वारा गैर-संक्रामक बनाया गया है। यहां, हम एपटामर का चयन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो घातीय संवर्धन (एसईएलईएक्स) द्वारा लिगेंड के व्यवस्थित विकास का उपयोग करके संक्रामक वायरस बनाम गैर-संक्रामक वायरस को अलग कर सकता है। हम SELEX की दो विशेषताओं का लाभ उठाते हैं। सबसे पहले, एसईएलईएक्स को काउंटर चयन का उपयोग करके प्रतिस्पर्धी लक्ष्यों, जैसे गैर-संक्रामक वायरस या अन्य समान वायरस को हटाने के लिए तैयार किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, पूरे वायरस को एसईएलईएक्स के लिए लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक वायरल सतह प्रोटीन के बजाय। संपूर्ण वायरस एसईएलईएक्स एपटामर के चयन की अनुमति देता है जो वायरस को बाधित करने की आवश्यकता के बिना विशेष रूप से वायरस की मूल स्थिति से जुड़ते हैं। यह विधि इस प्रकार रोगजनकों की सतह में कार्यात्मक अंतर के आधार पर मान्यता एजेंटों को प्राप्त करने की अनुमति देती है, जिन्हें पहले से जानने की आवश्यकता नहीं है।
Introduction
वायरस संक्रमण का दुनिया भर में भारी आर्थिक और सामाजिक प्रभाव है, जैसा कि हाल ही में कोविड-19 महामारी से तेजी से स्पष्ट हो गया है। स्वस्थ लोगों में वायरस के प्रसार को रोकने के दौरान वायरल संक्रमण के इलाज में समय पर और सटीक निदान सर्वोपरि है। जबकि कई वायरस का पता लगाने के तरीके विकसित किए गए हैं, जैसे कि पीसीआर परीक्षण1,2 और इनमुनोसेस3, वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश तरीके यह निर्धारित करने में सक्षम नहीं हैं कि पता लगाया गया वायरस वास्तव में संक्रामक है या नहीं। ऐसा इसलिए है क्योंकि अकेले वायरस के घटकों की उपस्थिति, जैसे वायरल न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन, यह संकेत नहीं देता है कि बरकरार, संक्रामक वायरस मौजूद है, और इन बायोमाकर्स के स्तर ने संक्रामकता 4,5,6 के साथ खराब सहसंबंध दिखाया है। उदाहरण के लिए, वायरल आरएनए, जिसे आमतौर पर वर्तमान पीसीआर-आधारित कोविड-19 परीक्षणों के लिए उपयोग किया जाता है, संक्रमण के शुरुआती चरणों में बहुत कम स्तर होता है जब रोगी संक्रामक होता है, जबकि आरएनए का स्तर अक्सर तब भी बहुत अधिक होता है जब रोगी संक्रमण से उबर चुके होते हैं और अब संक्रामक नहीं होते हैं। वायरल प्रोटीन या एंटीजन बायोमार्कर एक समान प्रवृत्ति का पालन करते हैं, लेकिन आमतौर पर वायरल आरएनए की तुलना में भी बाद में दिखाई देते हैं और इस प्रकार संक्रामकता 6,9 की भी कम भविष्यवाणी करते हैं। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, कुछ तरीके जो वायरस की संक्रामकता की स्थिति पर सूचित कर सकते हैं, विकसित किए गए हैं, लेकिन सेल कल्चर माइक्रोबायोलॉजी तकनीकों पर आधारित हैंजिन्हें परिणाम प्राप्त करने के लिए लंबे समय (दिनों या सप्ताहों) की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, नए सेंसर विकसित करना जो नैदानिक या पर्यावरणीय नमूनों की संक्रामकता पर सूचित कर सकते हैं, उपचार में देरी और वायरस के आगे प्रसार से बच सकते हैं। हालांकि, बहुत कम तरीके सेंसिंग अणुओं को प्राप्त कर सकते हैं जो एक बरकरार संक्रामक विषाणु को पहचान सकते हैं और इसे उसी वायरस से अलग कर सकते हैं जिसे गैर-संक्रामक बना दिया गया है।
इस संदर्भ में, एपटामर विशेष रूप से एक अद्वितीय बायोमोलेक्यूलर टूल 11,12,13,14 के रूप में अच्छी तरह से अनुकूल हैं। एपटामर एक विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के साथ छोटे, एकल-फंसे डीएनए या आरएनए अणु होते हैं जो उन्हें उच्च आत्मीयता और चयनात्मकता15,16 के साथ लक्ष्य को पहचानने के लिए एक विशिष्ट 3 डी रचना बनाने की अनुमति देता है। वे एक मिश्रित चयन प्रक्रिया द्वारा प्राप्त किए जाते हैं जिसे घातीय संवर्धन (एसईएलईएक्स) द्वारा लिगेंड का व्यवस्थित विकास कहा जाता है, जिसे इन विट्रो चयन के रूप में भी जाना जाता है, जो परीक्षण ट्यूबों में 1014-10 15 अनुक्रम17,18,19 अनुक्रमों की एक बड़ी यादृच्छिक डीएनए नमूना लाइब्रेरी के साथ किया जाता है।. इस पुनरावृत्ति प्रक्रिया के प्रत्येक दौर में, डीएनए पूल को पहले वांछित परिस्थितियों में लक्ष्य के साथ इनक्यूबेशन के माध्यम से चयन दबाव के अधीन किया जाता है। कोई भी अनुक्रम जो लक्ष्य से बंधे नहीं हैं, उन्हें हटा दिया जाता है, केवल उन कुछ अनुक्रमों को पीछे छोड़ दिया जाता है जो दी गई शर्तों के तहत बांधने में सक्षम हैं। अंत में, पिछले चरण में चुने गए अनुक्रमों को पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जाता है, जो चयन के अगले दौर के लिए वांछित कार्यात्मक अनुक्रमों के साथ पूल की आबादी को समृद्ध करता है, और प्रक्रिया दोहराई जाती है। जब चयन पूल की गतिविधि एक पठार (आमतौर पर 8-15 राउंड के बाद) तक पहुंच जाती है, तो लाइब्रेरी का विश्लेषण डीएनए अनुक्रमण द्वारा किया जाता है ताकि उच्चतम आत्मीयता प्रदर्शित करने वाले विजेता अनुक्रमों की पहचान की जा सके।
एसईएलईएक्स के अद्वितीय फायदे हैं जिनका उपयोग अन्य समान लक्ष्यों20,21 के खिलाफ बढ़ी हुई चयनात्मकता हासिल करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि वायरस22 की संक्रामकता स्थिति के लिए। सबसे पहले, चयन के लिए विभिन्न प्रकार के लक्ष्यों की एक विस्तृत विविधता का उपयोग किया जा सकता है, छोटे अणुओं और प्रोटीन से लेकर पूरे रोगजनकों और कोशिकाओंतक। इस प्रकार, एक एपटामर प्राप्त करने के लिए जो एक संक्रामक वायरस को बांधता है, एक वायरल सतह प्रोटीन19 के बजाय एक बरकरार वायरस को लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। संपूर्ण वायरस एसईएलईएक्स एपटामर के चयन की अनुमति देता है जो वायरस के विघटन की आवश्यकता के बिना विशेष रूप से वायरस की मूल स्थिति से जुड़ते हैं। दूसरा, सेलेक्स को चयन 22 के प्रत्येक दौर में काउंटर चयन चरणों का उपयोग करके प्रतिस्पर्धी लक्ष्य21,23, जैसे अन्य समान वायरस या गैर-संक्रामक निष्क्रिय वायरस को हटाने के लिए तैयार किया जा सकता है। काउंटर चयन चरणों के दौरान, डीएनए पूल को उन लक्ष्यों के संपर्क में लाया जाता है जिनके लिए बाइंडिंग वांछित नहीं है, और बांधने वाले किसी भी अनुक्रम को छोड़ दिया जाता है।
इस काम में, हम एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसे आम तौर पर एपटामर का चयन करने के लिए लागू किया जा सकता है जो एक संक्रामक वायरस से बंधते हैं, लेकिन उसी वायरस के लिए नहीं जो किसी विशेष कीटाणुशोधन विधि या किसी अन्य संबंधित वायरस द्वारा गैर-संक्रामक हो गया है। यह विधि वायरस की सतह के कार्यात्मक मतभेदों के आधार पर मान्यता एजेंटों को प्राप्त करने की अनुमति देती है, जिन्हें पहले से जानने की आवश्यकता नहीं होती है, और इसलिए नए उभरे रोगजनकों का पता लगाने या कम अध्ययन की गई बीमारियों के लिए एक अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एसईएलईएक्स न केवल पीएम-एनएम रेंज 22,43,44,45 में उच्च आत्मीयता वाले एपटामर की पहचान की अनुमति देता है, बल्कि उच्च और अक्षम चयनात्मकता के साथ भी अनुमति देता है।</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल (सार्स-सीओवी-2, सार्स-सीओवी-1, एच5एन1) में इस्तेमाल किए गए स्यूडोवायरस नमूने प्रदान करने के लिए शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय से सुश्री लौरा एम. कूपर और डॉ. लिजुन रोंग के साथ-साथ इलिनोइस विश्वविद्यालय में रॉय जे कार्वर बायोटेक्नोलॉजी सेंटर की डीएनए सेवा सुविधा के डॉ. अल्वारो हर्नांडेज़ और डॉ. क्रिस राइट को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ उनकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। और लू समूह के कई सदस्य जिन्होंने इन विट्रो चयन और एपटामर लक्षण वर्णन तकनीकों के साथ हमारी मदद की है। इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (सीबीईटी 20-29215) से रैपिड अनुदान और इलिनोइस विश्वविद्यालय में इंस्टीट्यूट फॉर सस्टेनेबिलिटी, एनर्जी एंड एनवायरनमेंट से एक बीज अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एएसपी वित्तीय सहायता के लिए पीईडब्ल्यू लैटिन अमेरिकी फैलोशिप को धन्यवाद देता है। वेल्च फाउंडेशन (ग्रांट एफ -0020) को ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय में लू समूह अनुसंधान कार्यक्रम के समर्थन के लिए भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 10% Ammonium persulfate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 1x PBS without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CM | |
| 40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution | BioRad | 1610146 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA clean-up beads – Section 7.2.2 |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merck | UFC501024 | cut-off 10 kDa |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merck | UFC510024 | cut-off 100 kDa |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | 100165 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module | BioRad | 1851148 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Scientific | 88870001 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Thermo Fisher | 65001 | streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9 |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | 324503 | |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | 1.5 mL |
| Lenti-X p24 Rapid Titer Kit | Takara Bio USA, Inc. | 632200 | Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1 |
| MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube | Thermo Scientific | MR02 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | non-UV absorbing |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels | BioRad | 1658004EDU | |
| Mini-PROTEAN Short Plates | BioRad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers | BioRad | 1653310 | |
| Molecular Biology Grade Water | Lonza | 51200 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear | BioRad | MLP9611 | |
| Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| OneTaq DNA Polymerase | New England BioLab | M0480S | |
| Ovation Ultralow v2 + UDI | Tecan | 0344NB-A01 | High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2. |
| PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) | Gilson | F144059M, F144058M, F144056M, F144054M | |
| Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 4261 | |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | fluorescence-based dsDNA quantification kit – Section 7.2.3 |
| SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) | Thomas Scientific | 1158U43, 1159M44, 1158U40 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002440 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 1725201 | qPCR mastermix – Section 6.2. |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 | USA scientific | AB1183 | PCR tubes |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5128 |
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