我们提供了一种通用的实验方案，可用于筛选仅结合具有感染性的病毒、而不结合因消毒方法而失去感染性的病毒或其他类似病毒的适配体。这为在便携式快速检测中确定病毒的感染状态提供了可能。
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本文内容
摘要
摘要
病毒感染对社会具有重大影响；目前大多数检测方法难以判断所检测到的病毒是否具有感染性，从而导致治疗延误并加剧病毒传播。开发能够判断临床或环境样本中病毒是否具有感染性的新型传感器，将有助于解决这一尚未满足的需求。然而，极少有方法能够获得可识别完整且具有感染性病毒、并将其与经消毒处理后失去感染性的同种病毒区分开的传感分子。本文介绍一种利用配体指数富集系统进化（SELEX）技术筛选可区分感染性病毒与非感染性病毒的适配体的实验方案。该方法利用了SELEX技术的两个特点：首先，SELEX可通过反向筛选去除竞争性靶标，例如非感染性病毒或其他相似病毒，从而实现定制化筛选；其次，SELEX可直接以完整病毒作为靶标，而非仅使用病毒表面蛋白等单一组分。采用完整病毒进行SELEX筛选，可获得特异性结合病毒天然构象的适配体，且无需破坏病毒结构。因此，该方法能够基于病原体表面的功能差异来获取识别分子，而这些功能差异无需在实验前预先知晓。
引言
病毒感染对全球的经济和社会产生了巨大影响，这一点在最近的 COVID-19 大流行中愈发明显。及时且准确的诊断对于治疗病毒感染以及防止病毒传播给健康人群至关重要。尽管目前已开发出多种病毒检测方法，例如 PCR 检测1,2 和免疫分析法3，但大多数现有方法无法判断所检测到的病毒是否具有实际感染能力。这是因为仅存在病毒组分（如病毒核酸或蛋白质）并不能说明完整且具有感染性的病毒存在，这些生物标志物的水平与感染性之间的相关性较差4,5,6。例如，目前基于 PCR 的 COVID-19 检测常用的病毒 RNA，在患者具有传染性的感染初期水平极低，而当患者已康复且不再具有传染性时，RNA 水平仍可能非常高7,8。病毒蛋白或抗原生物标志物也呈现类似趋势，但通常比病毒 RNA 出现更晚，因此对传染性的预测能力更差6,9。为解决这一局限性，已开发出一些能够反映病毒感染能....
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方案
1. 试剂与缓冲液的准备
- 通过加入0.9 M Tris碱、0.9 M硼酸、20 mM EDTA（二钠盐）以及去离子水，定容至1 L，配制10倍浓度Tris-硼酸-EDTA缓冲液（10x TBE）。搅拌至所有组分完全溶解。
- 按如下方法配制10%变性聚丙烯酰胺储备溶液。在250 mL玻璃瓶中，加入120 g尿素（8 M）、25 mL 10x TBE、62.5 mL 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液，并加入蒸馏水定容至250 mL。搅拌至所有组分完全溶解。
- 按如下方法配制2x上样缓冲液。在50 mL离心管中，加入21.636 g尿素（8 M）、1.675 g EDTA（1 mM）和4.5 mL 10x TBE。用蒸馏水定容至45 mL，并搅拌至所有组分完全溶解。
- 通过加入100 mM乙酸钠和1 mM EDTA（二钠盐）配制提取缓冲液。将最终pH值调节至5。
- 按如下方法配制乙醇沉淀溶液。配制3 M乙酸钠溶液，调节pH至5.2，于4 °C保存。配制70%（v/v）乙醇溶液，于-20 °C保存。配制100%乙醇，于-20 °C保存。
- 配制500 mL SELEX缓冲液，其中含1x PBS、2.5 mM MgCl2和0.5 mM CaCl2。调节pH至7.4。另配制100 mL含8 M尿素的SELEX缓冲液，其中含1x PBS、2.5 ....
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结果
由于DNA适配体可以在试管中通过SELEX技术获得15，因此本SELEX策略经过精心设计，既包含针对完整且具有感染性的完整病毒的正向筛选步骤（即保留能够与感染性病毒结合的DNA分子），也包含针对经特定消毒方法（特别是紫外线处理）灭活后的同种病毒的反向筛选步骤，通过剔除能与非感染性病毒结合的DNA序列来实现特异性富集。该筛选过程的示意图如图1所示。
作为本实验方案的代表性结果，我们选择了针对具有感染性的SARS-CoV-2病毒的适配体筛选。由于操作完整且具有感染性的SARS-CoV-2病毒需要在生物安全三级（BSL3）条件下进行，因此我们转而采用假病毒系统。假病毒是基于一种相对无害的骨架病毒（本研究中为慢病毒HIV）构建而成，通过在其病毒包膜中表达目标病毒的表面蛋白，使其能够模拟目标病毒的表面结构和入侵机制，同时避免操作高致病性人类病原体所带来的风险。重要的是，这些假病毒经过改造，无法持续进行病毒复制25, .......
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讨论
SELEX技术不仅能够筛选出具有高亲和力（pM至nM范围）22,43,44,45的适配体，还能获得具有高选择性且可调控选择性的适配体。通过利用反向筛选策略，可以获得具有挑战性区分能力的适配体。例如，Li研究组已证明能够获得可区分致病性与非致病性细菌菌株的序列21。此外，Le等人鉴定出一种能够区分化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）不同血清型的适配体46。这为将具有独特选择性的适配体分子整合到不同的功能化DNA传感器12,47,48,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们希望感谢来自芝加哥伊利诺伊大学的劳拉·M·库珀女士（Ms. Laura M. Cooper）和龙立军博士（Dr. Lijun Rong），他们为本实验方案提供了所用的假病毒样本（SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、H5N1）；同时感谢来自厄巴纳-香槟伊利诺伊大学罗伊·J·卡弗生物技术中心DNA服务设施的阿尔瓦罗·埃尔南德斯博士（Dr. Alvaro Hernandez）和克里斯·赖特博士（Dr. Chris Wright）在高通量测序方面给予的协助；并感谢卢课题组众多成员在本研究中提供的帮助 体外 筛选与适体表征技术。本研究得到了美国国家科学基金会快速响应研究计划（CBET 20-29215）以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校可持续性、能源与环境研究所和伊利诺伊-江苏产业技术研究院（JITRI 23965）种子基金的资助。A.S.P. 感谢PEW拉丁美洲研究员项目提供的经费支持。我们还感谢罗伯特·A·韦尔奇基金会（Grant F-0020）对德克萨斯大学奥斯汀分校Lu课题组研究项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 过硫酸铵（APS） | 伯乐（BioRad） | 1610700 | |
| 100% 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 不含钙的1x PBS &和镁 | 康宁 | 21-040-CM | |
| 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液 | 伯乐（BioRad） | 1610146 | |
| Agencourt AMPure XP 磁珠 | 贝克曼库尔特 | A63880 | DNA 纯化磁珠 - 第 7.2.2 节 |
| Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置 | 默克 | UFC501024 | 截留分子量 10 kDa |
| Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置 | 默克 | UFC510024 | 截留分子量 100 kDa |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | 100165 | |
| C1000 Touch 双 48/48 快速反应模块热循环仪 | 伯乐（BioRad） | 1851148 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统 | 伯乐（BioRad） | 1855201 | |
| 数字干浴器/金属浴加热器 | 赛默飞世尔科技 | 88870001 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | 赛默飞世尔科技 | 65001 | 链霉亲和素修饰的磁珠 - 第4.9节 |
| EDTA 二钠盐 | Sigma-Aldrich | 324503 | |
| Eppendorf Safe-Lock 微量离心管 | Sigma-Aldrich | T9661 | 1.5 mL |
| Lenti-X p24 快速滴定试剂盒 | Takara Bio USA, Inc. | 632200 | 慢病毒定量试剂盒 - 第 3.3.2.1 节 |
| MagJET 分离架，12 × 1.5 mL 管 | 赛默飞世尔科技 | MR02 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microseal 'B' PCR板密封膜，带粘合剂，光学级 | BioRad | MSB1001 | 非紫外吸收 |
| 用于 Ready Gel 预制胶的 Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽 | BioRad | 1658004EDU | |
| Mini-PROTEAN 短板 | BioRad | 1653308 | |
| 带有0.75 mm一体式垫片的Mini-PROTEAN间隔板 | 伯乐（BioRad） | 1653310 | |
| 分子生物学级水 | Lonza | 51200 | |
| 96孔PCR板，高型，无裙边，透明 | 伯乐（BioRad） | MLP9611 | |
| Nanodrop One | 赛默飞世尔科技 | ND-ONE-W | |
| OneTaq DNA聚合酶 | 新英格兰生物实验室 | M0480S | |
| Ovation Ultralow v2 + UDI | Tecan | 0344NB-A01 | 高通量测序文库制备试剂盒 - 第7.2节 |
| PIPETMAN G（100-1000） µ升，20-200 µL，2-20 µL 和 0.2-2 µL | Gilson | F144059M, F144058M, F144056M, F144054M | |
| Purifier Logic+ II级A2型生物安全柜 | Labconco | 4261 | |
| Qubit dsDNA BR 测定试剂盒 | Invitrogen | Q32850 | 基于荧光的 dsDNA 定量 试剂盒 - 第7.2.3节 |
| SHARP Classic 低吸附移液器吸头（10 μL，200 μL，1000 μL） | 托马斯科学公司 | 1158U43, 1159M44, 1158U40 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sorvall Legend Micro 17R 微型离心机 | 赛默飞世尔科技 | 75002440 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | 伯乐（BioRad） | 1725201 | qPCR预混液 - 第6.2节 |
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 管子和超透明盖，8个一排的连排管 | 美国科学 | AB1183 | PCR管 |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U5128 |
参考文献
- Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
- Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020)....
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