생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가
Summary
제시된 프로토콜은 미세유체 동적 배양 채널과 기존의 고정 웰 정적 배양 챔버에서 부착 세포층 구조를 시각화하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색 기술의 개발 및 사용을 설명합니다. 이 접근법은 세포층 밀도, 단층 형성 및 층 두께 균일성을 평가하는 데 도움이 됩니다.
Abstract
시험관 내 미세유체 실험은 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 인공호흡기 유발 폐 손상(VILI)과 같은 상태에서 발생하는 미세생리학적 현상에 대한 많은 통찰력을 밝힐 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 인간 폐의 말단 세기관지와 생리학적으로 관련된 치수를 가진 미세유체 채널에 대한 연구는 현재 몇 가지 문제에 직면해 있으며, 특히 주어진 배양 환경 내에서 배지 유속을 포함한 적절한 세포 배양 조건을 설정하는 데 어려움이 있습니다. 제시된 프로토콜은 인간 폐의 말단 세기관지와 생리학적으로 관련된 치수를 갖는 산소 불투과성 미세유체 채널에서 배양된 NCI-H441 인간 폐 상피 세포의 구조를 평가하기 위한 이미지 기반 접근법을 설명합니다. 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색을 사용하여 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 세포의 세포골격 구조를 밝혀 개별 세포와 층상 세포를 시각화할 수 있습니다. 후속 정량화는 사용되는 세포 배양 조건이 추가 실험에 적합한 균일한 단층을 생성하는지 여부를 결정합니다. 이 프로토콜은 미세유체 채널과 기존의 고정 웰 환경에서 세포 배양 및 층 평가 방법을 설명합니다. 여기에는 채널 구성, 세포 배양 및 필수 조건, 고정, 투과화 및 염색, 컨포칼 현미경 이미징, 이미지 처리 및 데이터 분석이 포함됩니다.
Introduction
급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 폐 실질의 손상 및 손상의 전파로 인해 발생하는 급성 질환으로, 폐포의 폐부종, 부적절한 가스 교환 및 그에 따른 저산소혈증을 유발합니다1. 이는 전염증성 사이토카인 방출, 호중구 모집, 독성 매개체 방출 및 조직 손상의 주기를 시작하며, 그 자체로 추가적인 염증 반응을 일으킨다2. 또한, 기도를 안정시키고 반복적인 동원/폐위(R/D)로 인한 손상을 방지하는 폐 계면활성제는 ARDS 동안 발생하는 화학적 과정에 의해 비활성화되거나 기능 장애를 일으켜 주변 실질에 추가적인 스트레스와 손상을 초래할 수 있다3. 충분한 손상이 지속되면 적절한 전신 산소 공급을 보장하기 위해 기계적 환기가 필요할 수 있습니다4. 그러나 기계적 환기는 과팽창(volutrauma) 및/또는 체액 폐색 기도의 공기-액체 계면의 R/D(atelectrauma) 동안 부과된 기계적 스트레스로 인한 폐 실질 손상으로 특징지어지는 인공호흡기 유발 폐 손상(VILI)의 가능성을 포함하여 고유한 문제와 트라우마를 부과합니다.5. atelectrauma 모델에서 공기-액체 계면(유체 폐색 세기관지에서와 같이)에 노출된 상피 세포가 경험하는 압력 구배는 투과성 유래 폐쇄 반응(POOR)을 유발할 수 있으며, 이는 손상의 POOR-GET-POORer 선순환으로 이어질 수 있습니다 6,7,8.
체외 실험은 이러한 현상에 대한 미시적 통찰력을 제공할 수 있지만, 생리학적으로 관련된 차원을 가진 미세유체 채널 환경에 대한 현재 연구는 몇 가지 문제에 직면해 있습니다9. 첫째, 세포 배양 조건을 최적화하는 것은 배지 흐름 매개변수, 배양 기간 및 기타 배양 조건이 최적의 세포층 형성을 허용하는 좁은 교차점이 존재하기 때문에 미세유체 환경에서 세포 배양 연구에 상당한 진입 장벽이 됩니다. 여기에는 미세유체 배양 채널 인클로저의 산소 불투과성 특성에 의해 부과되는 확산 제한이 포함됩니다. 이를 위해서는 매체 흐름 매개변수를 신중하게 고려해야 하는데, 낮은 유속은 세포, 특히 입구에서 가장 멀리 떨어진 세포에서 산소를 박탈할 수 있기 때문입니다. 반면에 높은 유속은 세포를 배양 채널 밖으로 밀어내거나 부적절하거나 고르지 않은 층 발달을 초래할 수 있습니다. 확산 제한은 공기-액체 계면(ALI) 배양 장치에서 폴리디메틸실록산(PDMS)과 같은 산소 투과성 물질을 사용하여 해결할 수 있습니다. 그러나, 전기 세포-기질 임피던스 센싱(ECIS) 시스템의 것과 같은 많은 종래의 미세유체 배양 채널은 제조된 인클로저(10)의 특성을 고려할 때, 본질적으로 산소-불투과성이다. 이 프로토콜은 산소 불투과성 인클로저에서 배양된 세포층을 분석하는 기술을 제공하는 것을 목표로 합니다.
배양 조건의 생존 가능성을 비교할 때, 단층의 존재, 표면 토폴로지, 밀도 및 층 두께 균일성과 같은 특정 층 특성의 관찰은 특정 배양 조건 세트에 의해 생성된 세포층이 원하는 사양을 충족하는지 여부를 결정하는 데 필요하며 실제로 실험 설계와 관련이 있습니다. 제한된 평가는 유동 어레이 내의 금 전극에서 배양된 세포의 전기 절연막에 의해 부과된 고주파 교류(AC)(임피던스)에 대한 저항에 의해 생성된 전위(전압)의 측정을 활용하는 ECIS와 같은 방법으로 수행될 수 있습니다. 세포에 가해지는 AC의 주파수를 조절함으로써, 표면 부착 강도, 밀착 접합 형성, 세포 증식 또는 밀도와 같은 세포 및 세포층의 특정 주파수 의존적 세포 특성을 표적으로 삼고 검사할 수 있다11. 그러나 이러한 간접적인 형태의 측정은 실험 초기에 해석하기가 다소 어려우며 세포층의 모든 관련 측면을 정량화하지 못할 수 있습니다. 위상차 현미경으로 세포층을 관찰하는 것만으로도 밀도와 같은 특정 특성의 특성을 알 수 있습니다. 그러나, 단층의 존재 및 층-두께 균일성과 같은 많은 관련 특성들은 명시야, 위상차 또는 형광 현미경 이미징(12)으로는 불가능한 3차원(3D) 평가를 필요로 한다.
이 연구의 목적은 단층의 이미징 기반 검증과 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 세포층 균일성을 평가할 수 있는 필라멘트-액틴 염색 기술을 개발하는 것이었습니다. 필라멘트-액틴(F-actin)은 부분적으로 F-액틴이 세포막을 밀접하게 따라가는 방식으로 인해 형광단 접합체에 대한 적절한 표적으로 간주되어 전체 세포 부피의 시각적 근사치를 허용합니다(13). F-액틴을 표적으로 하는 또 다른 중요한 이점은 F-액틴의 염색이 세포가 경험하는 스트레스와 변형에 의해 부과된 세포골격 파괴 또는 변경을 시각적으로 설명하는 방식입니다. 메탄올과 같은 탈수 고정제는 세포를 평평하게 하여 세포층을 심하게 왜곡하고 그 특성을 변경하는 경향이 있기 때문에 메탄올이 없는 포름알데히드를 사용한 가교 고정은 세포와 세포층의 형태를 보존하는 데 사용되었습니다14,15.
이러한 문제를 완화하기 위한 층 평가 기술의 능력을 결정하기 위해 세포를 기존의 8웰 배양 챔버와 미세유체 채널에서 배양하여 생산된 세포층의 차이(있는 경우)를 평가했습니다. 고정 배양 웰의 경우 8개의 웰 챔버 커버유리 장치가 사용되었습니다. 미세유체 배양을 위해, 유동 어레이(채널 길이 50 mm, 폭 5 mm, 깊이 0.6 mm)는 인간 폐의 호흡 영역에 존재하는 말단 세기관지와 생리학적으로 관련된 치수를 갖는 환경에서 불멸화된 인간 폐 상피(NCI-H441) 세포를 배양하도록 최적화되었다16. 이 프로토콜은 ECIS 플로우 어레이의 배양 환경을 염두에 두고 개발되었지만, 배양된 세포층 특성 또는 배양 조건의 평가가 필요한 모든 산소 불투과성 동적 배양 환경에 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 단일 채널 미세유체 흐름 어레이의 동적 환경과 기존의 8웰 챔버 커버글라스의 정적 환경에서 NCI-H441 인간 폐 상피 세포의 배양, 가교 고정, 염색, 투과화 및 컨포칼 현미경 시각화를 설명합니다. 모든 미세유체 세포 배양 프로토콜에서 세포 배양 배지의 흐름 조건은 고속 흐름이 세포를 씻어내거나 세포 단층의 정상적인 조립을 방해할 가능성이 있기 때문에 가장 중요합니다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 미세유체 채널 구성에 사용되는 3M 접착제 및 마일라 시트의 절단 패턴을 설계하고 세포 배양 배지 유속 및 주사기 펌프 프로그래밍을 테스트한 Alan Shepardson에게 감사를 표합니다. 자금은 NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 및 Newcomb-Tulane College Dean’s Grant에서 제공했습니다.
Materials
| A1R HD25 Confocal Microscope System | Nikon | A1R HD25 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications |
| ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) | Invitrogen | R37110 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110 |
| Adhesive Transfer Tape Double Linered | 3M | 468MP | https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/ |
| Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes | Air-Tite RL5 | 14-817-53 | https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml |
| BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet | BAISDY | AS022 | https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC |
| Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | 15-336-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100 |
| Corning Fibronectin, Human | Fisher Scientific | CB-40008 | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 |
| ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array | Applied BioPhysics | 1F8x10E PC | https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E |
| Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White | Enterprise Technology Solutions | 50-211-1163 | https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079 |
| Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes | Thermo Scientific | 4642090 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090 |
| Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 06-443-21 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269 |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) | Fisher Scientific | 12-544-GP | https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-458 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458 |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093 |
| Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) | Invitrogen | FB002 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002 |
| ImageJ Fiji | ImageJ | ImageJ Fiji | https://imagej.net/downloads |
| Immersion Oil F 30 cc | Nikon | MXA22168 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel | Thermo Scientific | 3950 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950 |
| Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System | Laxco | LMC3BF1 | https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1 |
| Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK | Masterflex | ZY-45505-31 | https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB |
| Microsoft Excel | Microsoft | 0016 | https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547 |
| National Target All-Plastic Disposable Syringes | Thermo Scientific | 03-377-24 | https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8 |
| NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-174 | https://www.atcc.org/products/htb-174 |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | https://www.syringepump.com/NE-16001800.php |
| NIS Elements AR | Nikon | NIS Elements AR | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605 |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155411 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361 |
| Parafilm M Wrapping Film | Fisher Scientific | S37441 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441 |
| PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch | PendoTech | ZY-19406-49 | https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649 |
| Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Poly-D-Lysine | Gibco | A3890401 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401 |
| Reynolds Aluminum Wrap Foil | Reynolds | 458742928317 | https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M |
| Saponin | Millipore Sigma (Sigma Aldrich) | 47036 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036 |
| SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant | Invitrogen | S36917-5X2ML | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML |
| Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package | Thermo Scientific | 13-100-752PM | https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood |
| Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft | Cole-Parmer | EW-95702-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01 |
References
- Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
- Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
- Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
- Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
- Jacob, A. -. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
- Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
- Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
- Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
- Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
- Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
- Lust, R. M. . The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , 1-6 (2007).
- EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , (2022).
- Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
- Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
- New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , (2014).
- Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , (2018).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
- Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , (2022).
- Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022)
- Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
- Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 296-315 (1999).
- Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
- Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).
