التحضير والتقييم الهيكلي للطبقات الأحادية للخلايا الظهارية في جهاز زراعة الموائع الدقيقة بحجم فسيولوجي
Summary
يصف البروتوكول المقدم تطوير واستخدام تقنية تلطيخ الأكتين الخيطي القائم على الفالويدين مع مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM) لتصور بنية طبقة الخلية الملتصقة في قنوات الثقافة الديناميكية للسوائع الدقيقة وغرف الاستزراع الثابتة التقليدية للبئر الثابت. يساعد هذا النهج في تقييم التقاء طبقة الخلية ، وتكوين الطبقة الأحادية ، وتوحيد سمك الطبقة.
Abstract
تحمل تجارب الموائع الدقيقة في المختبر إمكانات كبيرة للكشف عن العديد من الأفكار حول الظواهر الفسيولوجية الدقيقة التي تحدث في حالات مثل متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) وإصابة الرئة التي يسببها جهاز التنفس الصناعي (VILI). ومع ذلك ، فإن الدراسات في قنوات الموائع الدقيقة ذات الأبعاد الفسيولوجية ذات الصلة بالقصيبات الطرفية للرئة البشرية تواجه حاليا العديد من التحديات ، خاصة بسبب الصعوبات في إنشاء ظروف زراعة الخلايا المناسبة ، بما في ذلك معدلات تدفق الوسائط ، داخل بيئة مزرعة معينة. يصف البروتوكول المقدم نهجا قائما على الصور لتقييم بنية الخلايا الظهارية الرئوية البشرية NCI-H441 المزروعة في قناة الموائع الدقيقة غير المنفذة للأكسجين بأبعاد ذات صلة فسيولوجية بالقصيبات الطرفية للرئة البشرية. باستخدام تلطيخ الأكتين الخيطي القائم على الفالويدين ، يتم الكشف عن الهياكل الهيكلية الخلوية للخلايا بواسطة الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ، مما يسمح بتصور الخلايا الفردية وكذلك الطبقات. يحدد القياس الكمي اللاحق ما إذا كانت ظروف زراعة الخلايا المستخدمة تنتج طبقات أحادية موحدة مناسبة لمزيد من التجارب. يصف البروتوكول زراعة الخلايا وطرق تقييم الطبقة في قنوات الموائع الدقيقة وبيئات الآبار الثابتة التقليدية. وهذا يشمل بناء القناة ، وزراعة الخلايا والظروف المطلوبة ، والتثبيت ، والنفاذية والتلوين ، والتصوير المجهري متحد البؤر ، ومعالجة الصور ، وتحليل البيانات.
Introduction
متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) هي حالة حادة تنشأ عن إهانة وانتشار الإصابة في حمة الرئة ، مما يؤدي إلى وذمة رئوية في الحويصلات الهوائية ، وعدم كفاية تبادل الغازات ، ونقص الأكسجة اللاحق1. هذا يبدأ دورة من إطلاق السيتوكين المؤيد للالتهابات ، وتجنيد العدلات ، وإطلاق الوسيط السام ، وتلف الأنسجة ، والذي يؤدي في حد ذاته إلى مزيد من الاستجابة الالتهابية2. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم تعطيل الفاعل بالسطح الرئوي ، الذي يعمل على استقرار الشعب الهوائية ويمنع الضرر الناجم عن التوظيف / إلغاء التوظيف المتكرر (R / D) ، أو جعله مختلا وظيفيا بسبب العمليات الكيميائية التي تحدث أثناء متلازمة الضائقة التنفسية الحادة ، مما يؤدي إلى مزيد من الإجهاد والإصابة في الحمة المحيطة3. في حالة حدوث ضرر كاف ، قد تكون التهوية الميكانيكية ضرورية لضمان الأوكسجين الجهازي الكافي4. ومع ذلك ، تفرض التهوية الميكانيكية تحدياتها وصدماتها الخاصة ، بما في ذلك إمكانية إصابة الرئة التي يسببها جهاز التنفس الصناعي (VILI) ، والتي تتميز بأنها إصابة لحمة الرئة بسبب الضغوط الميكانيكية المفروضة أثناء التضخم المفرط (الصدمة الزائدة) و / أو R / D لواجهة الهواء والسائل في مجرى الهواء المغلق بالسوائل (atelectrauma)5. يمكن أن يؤدي تدرج الضغط الذي تعاني منه الخلايا الظهارية المعرضة لواجهة الهواء والسائل (كما هو الحال في القصيبات الهوائية المسدودة بالسائل) في نموذج atelectrauma إلى استجابة انسداد ناشئة عن النفاذية (POOR) ، مما يؤدي إلى دورة حميدة من الإصابة6،7،8.
يمكن أن توفر التجارب في المختبر رؤى على نطاق صغير لهذه الظواهر ، لكن الدراسات الحالية في بيئات قنوات الموائع الدقيقة ذات الأبعاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية تواجه العديد من التحديات9. أولا ، يشكل تحسين ظروف زراعة الخلايا حاجزا كبيرا أمام الدخول لأبحاث زراعة الخلايا في بيئات الموائع الدقيقة ، حيث يوجد تقاطع ضيق تسمح فيه معلمات تدفق الوسائط ومدة الثقافة وظروف الثقافة الأخرى بتكوين طبقة الخلية المثلى. وهذا يشمل قيود الانتشار التي تفرضها الطبيعة غير المنفذة للأكسجين لحاوية قناة ثقافة الموائع الدقيقة. وهذا يستلزم دراسة متأنية لمعلمات تدفق الوسائط ، حيث أن معدلات التدفق المنخفضة يمكن أن تحرم الخلايا من الأكسجين ، خاصة تلك الأبعد عن المدخل ؛ من ناحية أخرى ، يمكن أن تدفع معدلات التدفق العالية الخلايا خارج قناة الثقافة أو تؤدي إلى تطور طبقة غير لائق أو غير متساو. ويمكن معالجة قيود الانتشار باستخدام مواد منفذة للأكسجين مثل بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) في جهاز استزراع السطح البيني بين الهواء والسائل (ALI)؛ ومع ذلك ، فإن العديد من قنوات زراعة الموائع الدقيقة التقليدية ، مثل تلك الخاصة بنظام استشعار مقاومة الخلايا الخلوية الكهربائية (ECIS) ، غير منفذة للأكسجين بطبيعتها ، نظرا لطبيعة العلبة المصنعة10. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير تقنية لتحليل طبقات الخلايا المزروعة في حاوية غير منفذة للأكسجين.
عند مقارنة صلاحية ظروف الاستزراع، فإن ملاحظات خصائص طبقة محددة، مثل وجود طبقة أحادية، وطوبولوجيا السطح، والتلاقي، وتوحيد سمك الطبقة، ضرورية لتحديد ما إذا كانت طبقة الخلية التي تنتجها مجموعة معينة من ظروف الاستزراع تفي بالمواصفات المطلوبة وذات صلة بالفعل بالتصميم التجريبي. يمكن إجراء تقييم محدود بطرق مثل ECIS ، والتي تستخدم قياسات الجهد الكهربائي (الجهد) الناتج عن مقاومة التيار المتردد عالي التردد (AC) (المعاوقة) التي تفرضها الأغشية العازلة كهربائيا للخلايا المزروعة على أقطاب ذهبية داخل مجموعة التدفق. من خلال تعديل تردد التيار المتردد المطبق على الخلايا ، يمكن استهداف وفحص الخصائص الخلوية المحددة المعتمدة على التردد للخلايا وطبقات الخلايا مثل قوة التصاق السطح ، وتشكيل الوصلة الضيقة ، وتكاثر الخلايا أو التقائها11. ومع ذلك ، يصعب إلى حد ما تفسير هذه الأشكال غير المباشرة من القياسات في بداية التجربة ، وقد لا تحدد جميع الجوانب ذات الصلة بطبقة الخلية. إن مجرد مراقبة طبقة الخلية تحت مجهر تباين الطور قد يكشف عن طبيعة صفات معينة مثل التقارب. ومع ذلك ، فإن العديد من الخصائص ذات الصلة مثل وجود توحيد أحادي الطبقة وسمك الطبقة تتطلب تقييما ثلاثي الأبعاد (3D) غير ممكن مع التصوير المجهري الساطع أو تباين الطور أو التصوير المجهري الفلوري12.
كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير تقنية تلطيخ الأكتين الخيطي للسماح بالتحقق القائم على التصوير لطبقة أحادية وتقييم توحيد طبقة الخلية باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM). اعتبر الأكتين الخيطي (F-actin) هدفا مناسبا لاقتران الفلوروفور ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الطريقة التي يتبع بها F-actin غشاء الخلية بإحكام ، مما يسمح بتقريب بصري لحجم الخليةبأكمله 13. فائدة أخرى مهمة لاستهداف F-actin هي الطريقة التي يوضح بها تلطيخ F-actin بصريا الاضطرابات أو التغيرات الهيكلية الخلوية التي تفرضها الضغوط والسلالات التي تعاني منها الخلايا. تم استخدام التثبيت المتشابك مع الفورمالديهايد الخالي من الميثانول للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا وطبقة الخلية ، حيث تميل مثبتات التجفيف مثل الميثانول إلى تسطيح الخلايا ، مما يؤدي إلى تشويه طبقة الخلية بشكل كبير وتغيير خصائصها14,15.
لتحديد قدرة تقنية تقييم الطبقة على التخفيف من هذه التحديات ، تم استزراع الخلايا في غرف زراعة تقليدية من ثمانية آبار وكذلك في قنوات الموائع الدقيقة لتقييم الاختلافات ، إن وجدت ، في طبقات الخلايا التي تم إنتاجها. بالنسبة لآبار الاستزراع الثابتة ، تم استخدام وحدات زجاجية ذات ثماني غرف جيدة. بالنسبة لثقافة الموائع الدقيقة ، تم تحسين صفائف التدفق (طول القناة 50 مم ، العرض 5 مم ، العمق 0.6 مم) لزراعة الخلايا الظهارية للرئة البشرية (NCI-H441) في بيئة ذات أبعاد ذات صلة فسيولوجية بالقصيبات الطرفية الموجودة في المنطقة التنفسية للرئة البشرية16. في حين تم تطوير هذا البروتوكول مع وضع بيئة الاستزراع لمصفوفات تدفق ECIS في الاعتبار ، فقد ينطبق على أي بيئة ثقافة ديناميكية غير منفذة للأكسجين والتي يكون من الضروري تقييم خصائص طبقة الخلايا المستزرعة أو ظروف الاستزراع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول المقدم الثقافة ، والتثبيت المتشابك ، والتلوين ، والنفاذية ، والتصور المجهري متحد البؤر للخلايا الظهارية الرئوية البشرية NCI-H441 في البيئة الديناميكية لمجموعة تدفق الموائع الدقيقة أحادية القناة ، وكذلك في البيئة الثابتة لغطاء زجاجي تقليدي من ثماني غرف جيدا. مع أي بروتوكول لث…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بآلان شيباردسون لتصميمه نمط القطع لورقة 3M اللاصقة والمايلر المستخدمة في بناء قناة الموائع الدقيقة ولاختبار معدل تدفق وسائط زراعة الخلايا وبرمجة مضخة الحقنة. تم توفير التمويل من قبل NIH R01 HL0142702 ، و NSF CBET 1706801 ، ومنحة عميد كلية نيوكومب تولين.
Materials
| A1R HD25 Confocal Microscope System | Nikon | A1R HD25 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications |
| ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) | Invitrogen | R37110 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110 |
| Adhesive Transfer Tape Double Linered | 3M | 468MP | https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/ |
| Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes | Air-Tite RL5 | 14-817-53 | https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml |
| BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet | BAISDY | AS022 | https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC |
| Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | 15-336-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100 |
| Corning Fibronectin, Human | Fisher Scientific | CB-40008 | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 |
| ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array | Applied BioPhysics | 1F8x10E PC | https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E |
| Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White | Enterprise Technology Solutions | 50-211-1163 | https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079 |
| Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes | Thermo Scientific | 4642090 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090 |
| Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 06-443-21 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269 |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) | Fisher Scientific | 12-544-GP | https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-458 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458 |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093 |
| Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) | Invitrogen | FB002 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002 |
| ImageJ Fiji | ImageJ | ImageJ Fiji | https://imagej.net/downloads |
| Immersion Oil F 30 cc | Nikon | MXA22168 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel | Thermo Scientific | 3950 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950 |
| Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System | Laxco | LMC3BF1 | https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1 |
| Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK | Masterflex | ZY-45505-31 | https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB |
| Microsoft Excel | Microsoft | 0016 | https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547 |
| National Target All-Plastic Disposable Syringes | Thermo Scientific | 03-377-24 | https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8 |
| NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-174 | https://www.atcc.org/products/htb-174 |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | https://www.syringepump.com/NE-16001800.php |
| NIS Elements AR | Nikon | NIS Elements AR | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605 |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155411 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361 |
| Parafilm M Wrapping Film | Fisher Scientific | S37441 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441 |
| PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch | PendoTech | ZY-19406-49 | https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649 |
| Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Poly-D-Lysine | Gibco | A3890401 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401 |
| Reynolds Aluminum Wrap Foil | Reynolds | 458742928317 | https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M |
| Saponin | Millipore Sigma (Sigma Aldrich) | 47036 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036 |
| SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant | Invitrogen | S36917-5X2ML | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML |
| Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package | Thermo Scientific | 13-100-752PM | https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood |
| Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft | Cole-Parmer | EW-95702-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01 |
References
- Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
- Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
- Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
- Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
- Jacob, A. -. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
- Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
- Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
- Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
- Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
- Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
- Lust, R. M. . The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , 1-6 (2007).
- EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , (2022).
- Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
- Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
- New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , (2014).
- Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , (2018).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
- Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , (2022).
- Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022)
- Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
- Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 296-315 (1999).
- Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
- Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).
