Подготовка и структурная оценка монослоев эпителиальных клеток в физиологически размерном микрофлюидном культуральном устройстве
Summary
Представленный протокол описывает разработку и использование метода окрашивания нитчато-актинового лактина на основе фаллоидина с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) для визуализации структуры адгезивного клеточного слоя в микрофлюидных динамических культурных каналах и традиционных стационарных камерах статического культивирования. Этот подход помогает оценить слияние клеточного слоя, образование монослоя и однородность толщины слоя.
Abstract
Микрофлюидные эксперименты in vitro обладают большим потенциалом для раскрытия многих идей о микрофизиологических явлениях, происходящих при таких состояниях, как острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) и вызванное искусственной вентиляцией легких повреждение легких (ВИЛИ). Тем не менее, исследования микрофлюидных каналов с размерами, физиологически относящимися к терминальным бронхиолам легких человека, в настоящее время сталкиваются с рядом проблем, особенно из-за трудностей в установлении соответствующих условий культивирования клеток, включая скорость потока среды, в данной среде культивирования. Представленный протокол описывает основанный на изображениях подход к оценке структуры эпителиальных клеток легких человека NCI-H441, культивируемых в кислородонепроницаемом микрофлюидном канале с размерами, физиологически соответствующими терминальным бронхиолам легкого человека. Используя филлоидное окрашивание на основе филлоидина, цитоскелетные структуры клеток выявляются с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, что позволяет визуализировать как отдельные, так и слоистые клетки. Последующая количественная оценка определяет, производят ли используемые условия культивирования клеток однородные монослои, пригодные для дальнейших экспериментов. Протокол описывает методы оценки клеточных культур и слоев в микрофлюидных каналах и традиционных средах с фиксированными лунками. Это включает в себя построение канала, культуру клеток и необходимые условия, фиксацию, пермеабилизацию и окрашивание, конфокальную микроскопическую визуализацию, обработку изображений и анализ данных.
Introduction
Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) – это острое состояние, возникающее в результате инсульта и распространения повреждения паренхимы легкого, что приводит к отеку альвеол легких, недостаточному газообмену и последующей гипоксемии1. Это инициирует цикл высвобождения провоспалительных цитокинов, рекрутирования нейтрофилов, высвобождения токсического медиатора и повреждения тканей, что само по себе вызывает дальнейшую воспалительную реакцию2. Кроме того, легочный сурфактант, который стабилизирует дыхательные пути и предотвращает повреждение, вызванное повторяющимся набором/дерекрутированием (R/D), может быть инактивирован или иным образом дисфункционализирован химическими процессами, происходящими во время ОРДС, что приводит к дальнейшему стрессу и повреждению окружающей паренхимы3. Если получено достаточное повреждение, может потребоваться искусственная вентиляция легких для обеспечения адекватной системной оксигенации4. Однако искусственная вентиляция легких сопряжена с определенными проблемами и травмами, включая возможность поражения легких, вызванного искусственной вентиляцией легких (ВПЗ), характеризуемого как повреждение паренхимы легких, вызванное механическими нагрузками, возникающими при чрезмерном надувании (волютравма) и/или НИР границы раздела воздух-жидкость в окклюзированных жидкостью дыхательных путях (ателетравма)5. Градиент давления, испытываемый эпителиальными клетками, подвергшимися воздействию границы раздела воздух-жидкость (как в бронхиоле, окклюзированной жидкостью) в модели ателетравмы, может привести к обструктивному ответу, вызванному проницаемостью (POOR), что приводит к добродетельному циклу травмы 6,7,8.
Эксперименты in vitro могут дать представление об этих явлениях в микромасштабе, но текущие исследования в средах микрофлюидных каналов с физиологически значимыми размерами сталкиваются с несколькими проблемами9. Во-первых, оптимизация условий культивирования клеток представляет собой значительный барьер для входа в исследования клеточных культур в микрофлюидных средах, поскольку существует узкое пересечение, в пределах которого параметры потока среды, продолжительность культивирования и другие условия культивирования позволяют оптимально формировать клеточный слой. Это включает в себя ограничения диффузии, налагаемые непроницаемой для кислорода природой оболочки микрофлюидного культурального канала. Это требует тщательного рассмотрения параметров потока среды, так как низкие скорости потока могут лишить клетки кислорода, особенно те, которые находятся дальше всего от входного отверстия; С другой стороны, высокая скорость потока может вытолкнуть клетки из культурального канала или привести к неправильному или неравномерному развитию слоя. Ограничения диффузии могут быть устранены путем использования кислородопроницаемых материалов, таких как полидиметилсилоксан (ПДМС), в аппарате для культивирования раздела воздух-жидкость (ALI); однако многие традиционные каналы микрофлюидных культур, такие как каналы электрического датчика импеданса клетка-субстрат (ECIS), по своей природе непроницаемы для кислорода, учитывая природу изготовленного корпуса10. Этот протокол направлен на то, чтобы предоставить метод анализа клеточных слоев, культивируемых в непроницаемом для кислорода корпусе.
При сравнении жизнеспособности условий культивирования необходимы наблюдения за конкретными характеристиками слоя, такими как наличие монослоя, топология поверхности, слияние и однородность толщины слоя, чтобы определить, соответствует ли клеточный слой, полученный определенным набором условий культивирования, желаемым спецификациям и действительно ли они имеют отношение к экспериментальному дизайну. Ограниченная оценка может быть выполнена с помощью таких методов, как ECIS, в которых используются измерения электрического потенциала (напряжения), создаваемого сопротивлением высокочастотному переменному току (AC) (импедансу), налагаемому электрически изолирующими мембранами клеток, культивируемых на золотых электродах в массиве потока. Модулируя частоту переменного тока, приложенного к клеткам, можно нацелить и исследовать специфические частотно-зависимые клеточные свойства клеток и клеточных слоев, такие как прочность поверхностной адгезии, образование плотного соединения и пролиферация или слияние клеток11. Однако эти косвенные формы измерений довольно трудно интерпретировать в начале эксперимента, и они могут не дать количественной оценки всем соответствующим аспектам клеточного слоя. Простое наблюдение за клеточным слоем под фазово-контрастным микроскопом может выявить природу определенных качеств, таких как слияние; однако многие важные характеристики, такие как наличие монослоя и однородность толщины слоя, требуют трехмерной (3D) оценки, которая невозможна при светлом поле, фазовом контрасте или флуоресцентной микроскопической визуализации12.
Цель этого исследования состояла в том, чтобы разработать метод окрашивания нитевидного актина, позволяющий проводить верификацию монослоя на основе визуализации и оценку однородности клеточного слоя с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Филаментозный актин (F-актин) считался подходящей мишенью для флуорофорного конъюгата, отчасти из-за того, что F-актин плотно следует за клеточной мембраной, что позволяет визуально приблизить весь объемклетки 13. Еще одним важным преимуществом нацеливания на F-актин является способ, которым окрашивание F-актина визуально выясняет цитоскелетные нарушения или изменения, вызванные стрессами и деформациями, испытываемыми клетками. Сшивание фиксации с формальдегидом, не содержащим метанола, использовалось для сохранения морфологии клеток и клеточного слоя, поскольку дегидратирующие фиксаторы, такие как метанол, имеют тенденцию к сплющиванию клеток, грубо искажая клеточный слой и изменяя его свойства14,15.
Чтобы определить способность метода оценки слоя смягчить эти проблемы, клетки культивировали в традиционных восьмилуночных культуральных камерах, а также в микрофлюидных каналах для оценки различий, если таковые имеются, в клеточных слоях, которые были получены. Для стационарных культуральных колодцев использовались восьмилуночные камерные стеклопакеты. Для микрофлюидного культивирования проточные массивы (длина канала 50 мм, ширина 5 мм, глубина 0,6 мм) были оптимизированы для культивирования иммортализированных эпителиальных клеток легких человека (NCI-H441) в среде с размерами, физиологически соответствующими терминальным бронхиолам, присутствующим в дыхательной зоне легкогочеловека 16. Хотя этот протокол был разработан с учетом среды культивирования массивов потока ECIS, он может применяться к любой непроницаемой для кислорода среде динамического культивирования, для которой необходима оценка характеристик культивируемого клеточного слоя или условий культивирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
В представленном протоколе описаны культивирование, сшивание, фиксация, окрашивание, пермеабилизация и конфокальная микроскопическая визуализация эпителиальных клеток легких человека NCI-H441 в динамической среде одноканального микрофлюидного проточного массива, а также в статическо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Алану Шепардсону за разработку схемы резки клея 3M и майларового листа, используемых в конструкции микрофлюидных каналов, а также за тестирование скорости потока среды для культивирования клеток и программирование шприцевого насоса. Финансирование было предоставлено NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 и грантом декана колледжа Ньюкомб-Тулейн.
Materials
| A1R HD25 Confocal Microscope System | Nikon | A1R HD25 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications |
| ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) | Invitrogen | R37110 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110 |
| Adhesive Transfer Tape Double Linered | 3M | 468MP | https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/ |
| Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes | Air-Tite RL5 | 14-817-53 | https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml |
| BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet | BAISDY | AS022 | https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC |
| Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | 15-336-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100 |
| Corning Fibronectin, Human | Fisher Scientific | CB-40008 | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 |
| ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array | Applied BioPhysics | 1F8x10E PC | https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E |
| Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White | Enterprise Technology Solutions | 50-211-1163 | https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079 |
| Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes | Thermo Scientific | 4642090 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090 |
| Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 06-443-21 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269 |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) | Fisher Scientific | 12-544-GP | https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-458 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458 |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093 |
| Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) | Invitrogen | FB002 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002 |
| ImageJ Fiji | ImageJ | ImageJ Fiji | https://imagej.net/downloads |
| Immersion Oil F 30 cc | Nikon | MXA22168 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel | Thermo Scientific | 3950 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950 |
| Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System | Laxco | LMC3BF1 | https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1 |
| Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK | Masterflex | ZY-45505-31 | https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB |
| Microsoft Excel | Microsoft | 0016 | https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547 |
| National Target All-Plastic Disposable Syringes | Thermo Scientific | 03-377-24 | https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8 |
| NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-174 | https://www.atcc.org/products/htb-174 |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | https://www.syringepump.com/NE-16001800.php |
| NIS Elements AR | Nikon | NIS Elements AR | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605 |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155411 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361 |
| Parafilm M Wrapping Film | Fisher Scientific | S37441 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441 |
| PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch | PendoTech | ZY-19406-49 | https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649 |
| Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Poly-D-Lysine | Gibco | A3890401 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401 |
| Reynolds Aluminum Wrap Foil | Reynolds | 458742928317 | https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M |
| Saponin | Millipore Sigma (Sigma Aldrich) | 47036 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036 |
| SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant | Invitrogen | S36917-5X2ML | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML |
| Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package | Thermo Scientific | 13-100-752PM | https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood |
| Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft | Cole-Parmer | EW-95702-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01 |
References
- Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
- Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
- Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
- Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
- Jacob, A. -. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
- Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
- Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
- Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
- Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
- Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
- Lust, R. M. . The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , 1-6 (2007).
- EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , (2022).
- Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
- Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
- New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , (2014).
- Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , (2018).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
- Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , (2022).
- Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022)
- Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
- Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 296-315 (1999).
- Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
- Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).
