Med hjälp av ovo-elektroporering utarbetade vi en metod för att selektivt transfektera det auditiva innerörat och den cochleära kärnan i kycklingembryon för att uppnå en cellgruppsspecifik knockdown av bräckligt X-mental retardationsprotein under diskreta perioder av kretsmontering.
Fragile X mental retardation protein (FMRP) är ett mRNA-bindande protein som reglerar lokal proteinöversättning. FMRP-förlust eller dysfunktion leder till avvikande neuronala och synaptiska aktiviteter vid bräckligt X-syndrom (FXS), som kännetecknas av intellektuell funktionsnedsättning, sensoriska abnormiteter och sociala kommunikationsproblem. Studier av FMRP-funktion och FXS-patogenes har främst utförts med Fmr1 (genen som kodar för FMRP) knockout hos transgena djur. Här rapporterar vi en in vivo-metod för att bestämma den cellautonoma funktionen hos FMRP under perioden för kretsmontering och synaptisk bildning med kycklingembryon. Denna metod använder scen-, plats- och riktningsspecifik elektroporering av ett läkemedelsinducerbart vektorsystem innehållande Fmr1 litet hårnåls-RNA (shRNA) och en EGFP-reporter. Med denna metod uppnådde vi selektiv FMRP-knockdown i den auditiva ganglionen (AG) och i ett av dess hjärnstamsmål, kärnan magnocellularis (NM), vilket ger en komponentspecifik manipulation inom AG-NM-kretsen. Dessutom tillåter mosaikmönstret för transfektionen kontroller inom djur och närliggande neuron/ fiberjämförelser för förbättrad tillförlitlighet och känslighet vid dataanalys. Det inducerbara vektorsystemet ger tidsmässig kontroll av genredigeringsdebut för att minimera ackumulerande utvecklingseffekter. Kombinationen av dessa strategier ger ett innovativt verktyg för att dissekera FMRP: s cellautonoma funktion i synaptisk och kretsutveckling.
Bräckligt X-syndrom (FXS) är en neurodevelopmental störning som kännetecknas av intellektuell funktionsnedsättning, sensoriska abnormiteter och autistiska beteenden. I de flesta fall orsakas FXS av en global förlust av bräckligt X-mentalt retardationsprotein (FMRP; kodat av Fmr1-genen) som börjar i tidiga embryonala stadier1. FMRP är ett RNA-bindande protein som normalt uttrycks i de flesta nervceller och gliaceller i hjärnan, liksom i sensoriska organ 2,3,4. I däggdjurshjärnor är FMRP sannolikt associerat med hundratals mRNA som kodar för proteiner som är viktiga för olika neurala aktiviteter5. Studier av konventionella Fmr1-knockoutdjur visade att FMRP-uttryck är särskilt viktigt för montering och plasticitet av synaptisk neurotransmission6. Flera villkorliga och mosaik knockout-modeller har vidare visat att FMRP-åtgärder och signaler varierar mellan hjärnregioner, celltyper och synaptiska platser under flera utvecklingshändelser inklusive axonal projektion, dendritisk mönstring och synaptisk plasticitet 7,8,9,10,11,12,13,14 . Akut funktion av FMRP vid reglering av synaptisk överföring studerades genom intracellulär leverans av hämmande FMRP-antikroppar eller FMRP själv i hjärnskivor eller odlade neuroner15,16,17,18. Dessa metoder erbjuder dock inte möjligheten att spåra FMRP-feluttrycksinducerade konsekvenser under utvecklingen. Således är det i stort behov att utveckla in vivo-metoder för att undersöka FMRP: s cellautonoma funktioner och förväntas hjälpa till att avgöra om de rapporterade avvikelserna hos FXS-patienter är direkta konsekvenser av FMRP-förlust i de associerade neuronerna och kretsarna, eller sekundära konsekvenser härledda från nätverksomfattande förändringar under utveckling19.
Den auditiva hjärnstammen hos kycklingembryon erbjuder en unikt fördelaktig modell för djupgående funktionella analyser av FMRP-reglering i krets- och synapsutveckling. Den enkla tillgången till embryonala kycklinghjärnor och den väletablerade ovo-elektroporationstekniken för genmanipulation har i hög grad bidragit till vår förståelse av hjärnans utveckling i tidiga embryonala stadier. I en nyligen publicerad studie kombinerades denna teknik med avancerade molekylära verktyg som möjliggör tidsmässig kontroll av FMRP-feluttryck20,21. Här är metodiken avancerad för att inducera selektiva manipuleringar av presynaptiska och postsynaptiska neuroner separat. Denna metod utvecklades i den auditiva hjärnstamskretsen. Akustisk signal detekteras av hårceller i det auditiva innerörat och överförs sedan till den auditiva ganglionen (AG; även kallad spiral ganglion hos däggdjur). Bipolära nervceller i AG innerverar hårceller med sina perifera processer och skickar i sin tur en central projektion (hörselnerven) till hjärnstammen där de slutar i två primära cochleära kärnor, kärnan magnocellularis (NM) och kärnan angularis (NA). Neuroner i NM är strukturellt och funktionellt jämförbara med de sfäriska buskiga cellerna i däggdjurets anteroventrala cochleära kärna. Inom NM, hörselnervfibrer (ANFs) synaps på somata av NM-neuroner via den stora endbulben av Held-terminaler22. Under utvecklingen uppstår NM-neuroner från rhombomererna 5 och 6 (r5/6) i bakhjärnan23, medan AG-neuroner härrör från neuroblaster som bor i otocysten24. Här beskriver vi proceduren för att selektivt slå ner FMRP-uttryck i de presynaptiska AG-neuronerna och i de postsynaptiska NM-neuronerna separat.
För att bestämma FMRP: s cellautonoma funktion är det nödvändigt att manipulera dess uttryck i enskilda cellgrupper eller celltyper. Eftersom en av FMRP: s huvudfunktioner är att reglera synaptisk bildning och plasticitet, är selektiv manipulering av varje synaptisk komponent i en viss krets en förutsättning för en fullständig förståelse av FMRP-mekanismen i synaptisk kommunikation. Med hjälp av ovo-elektroporering av kycklingembryon demonstrerade vi en metod för a…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av: ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (nr 32000697); Vetenskaps- och teknikprogrammet i Guangzhou (202102080139); Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); Grundforskningsfonderna för de centrala universiteten (11620324). ett forskningsbidrag från Key Laboratory of Regenerative Medicine, utbildningsministeriet, Jinan University (nr. ZSYXM202107); Grundforskningsfonderna för Kinas centrala universitet (21621054). och Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen i Kina (20191118142729581). Vi tackar det medicinska experimentella centret vid Jinan University. Vi tackar Dr. Terra Bradley för noggrann redigering av manuskriptet.
Egg incubation | |||
16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
Plasmid preparation | |||
Centrifuge | Sigma | 10016 | |
Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
Electroporation and Doxycycline Administration | |||
Electroporator | BTX | ECM399 | |
1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Tissue Dissection and Fixation | |||
Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
Other surgery tools | RWD | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
Sectioning | |||
Cryostat | LEICA | CM1850 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
Immunostaining | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
Netwell plate | Corning | 3478 | |
Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
Imaging | |||
Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |