In Ovo Electroporation tarafından İşitsel Bir Devrede Kırılgan X Mental Retardasyon Proteininin Hücre Otonom Fonksiyonunun Diseksiyonu
Summary
Ovo elektroporasyonunu kullanarak, devre montajının ayrı dönemlerinde kırılgan X mental retardasyon proteininin hücre grubuna özgü bir nakavtını sağlamak için tavuk embriyolarındaki işitsel iç kulağı ve koklear çekirdeği seçici olarak transfekte etmek için bir yöntem geliştirdik.
Abstract
Frajil X mental retardasyon proteini (FMRP), lokal protein translasyonunu düzenleyen mRNA bağlayıcı bir proteindir. FMRP kaybı veya disfonksiyonu, zihinsel yetersizlik, duyusal anormallikler ve sosyal iletişim sorunları ile karakterize olan kırılgan X sendromunda (FXS) anormal nöronal ve sinaptik aktivitelere yol açar. FMRP fonksiyonu ve FXS patogenezi çalışmaları öncelikle transgenik hayvanlarda Fmr1 (FMRP’yi kodlayan gen) nakavtı ile yapılmıştır. Burada, tavuk embriyolarını kullanarak devre montajı ve sinaptik oluşum döneminde FMRP’nin hücre otonom fonksiyonunu belirlemek için in vivo bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, Fmr1 küçük saç tokası RNA’sı (shRNA) ve bir EGFP muhabiri içeren ilaca bağlı bir vektör sisteminin aşama, saha ve yöne özgü elektroporasyonunu kullanır. Bu yöntemle, işitsel ganglionda (AG) ve beyin sapı hedeflerinden biri olan çekirdek magnoselülarisinde (NM) seçici FMRP nakavtı elde ettik, böylece AG-NM devresinde bileşene özgü bir manipülasyon sağladık. Ek olarak, transfeksiyonun mozaik deseni, veri analizinde gelişmiş güvenilirlik ve duyarlılık için hayvan içi kontrollere ve komşu nöron / lif karşılaştırmalarına izin verir. İndüklenebilir vektör sistemi, biriken gelişimsel etkileri en aza indirmek için gen düzenleme başlangıcının zamansal kontrolünü sağlar. Bu stratejilerin kombinasyonu, FMRP’nin sinaptik ve devre geliştirmedeki hücre otonom işlevini incelemek için yenilikçi bir araç sağlar.
Introduction
Frajil X sendromu (FXS), zihinsel yetersizlik, duyusal anormallikler ve otistik davranışlarla karakterize nörogelişimsel bir bozukluktur. Çoğu durumda, FXS, erken embriyonik aşama1’den başlayarak kırılgan X zihinsel gerilik proteininin (FMRP; Fmr1 geni tarafından kodlanmış) küresel bir kaybından kaynaklanır. FMRP, normalde beyindeki çoğu nöronda ve glial hücrede ve ayrıca duyu organlarında eksprese edilen RNA bağlayıcı bir proteindir 2,3,4. Memeli beyinlerinde, FMRP muhtemelen çeşitli sinirsel aktiviteler için önemli olan proteinleri kodlayan yüzlerce mRNA ile ilişkilidir5. Konvansiyonel Fmr1 nakavt hayvanları üzerinde yapılan çalışmalar, FMRP ekspresyonunun sinaptik nörotransmisyon6’nın montajı ve plastisitesi için özellikle önemli olduğunu göstermiştir. Birkaç koşullu ve mozaik nakavt modeli, FMRP eylemlerinin ve sinyallerinin aksonal projeksiyon, dendritik modelleme ve sinaptik plastisite 7,8,9,10,11,12,13,14 dahil olmak üzere çeşitli gelişimsel olaylar sırasında beyin bölgeleri, hücre tipleri ve sinaptik bölgeler arasında değiştiğini göstermiştir. . FMRP’nin sinaptik iletimi düzenlemedeki akut fonksiyonu, inhibitör FMRP antikorlarının veya FMRP’nin kendisinin beyin dilimlerinde veya kültürlenmiş nöronlarda hücre içi verilmesi ile incelenmiştir15,16,17,18. Bununla birlikte, bu yöntemler, geliştirme sırasında FMRP yanlış ifadeye bağlı sonuçları izleme yeteneği sunmaz. Bu nedenle, FMRP’nin hücre otonom fonksiyonlarını araştırmak için in vivo yöntemlerin geliştirilmesine büyük ihtiyaç duyulmaktadır ve FXS hastalarında bildirilen anomalilerin, ilişkili nöronlardaki ve devrelerdeki FMRP kaybının doğrudan sonuçları mı yoksa gelişim sırasında ağ çapındaki değişikliklerden kaynaklanan ikincil sonuçlar mı olduğunu belirlemeye yardımcı olması beklenmektedir19.
Tavuk embriyolarının işitsel beyin sapı, devre ve sinaps gelişiminde FMRP regülasyonunun derinlemesine fonksiyonel analizleri için benzersiz bir avantajlı model sunar. Embriyonik tavuk beyinlerine kolay erişim ve genetik manipülasyon için köklü ovo elektroporasyon tekniği, erken embriyonik aşamalarda beyin gelişimini anlamamıza büyük katkıda bulunmuştur. Yakın zamanda yayınlanan bir çalışmada, bu teknik, FMRP yanlış ekspresyonu20,21’in zamansal kontrolüne izin veren gelişmiş moleküler araçlarla birleştirilmiştir. Burada, metodoloji, presinaptik ve postsinaptik nöronların seçici manipülasyonlarını ayrı ayrı indüklemek için geliştirilmiştir. Bu yöntem işitsel beyin sapı devresinde geliştirilmiştir. Akustik sinyal, işitsel iç kulaktaki saç hücreleri tarafından tespit edilir ve daha sonra işitsel gangliona (AG; memelilerde spiral ganglion olarak da adlandırılır) iletilir. AG’deki bipolar nöronlar, periferik süreçleriyle saç hücrelerini innerve eder ve sırayla beyin sapına merkezi bir projeksiyon (işitme siniri) gönderir ve burada iki primer koklear çekirdekte, çekirdek magnocellularis (NM) ve çekirdek angularis (NA) ile sona erer. NM’deki nöronlar, yapısal ve işlevsel olarak memeli anteroventral koklear çekirdeğinin küresel gür hücreleriyle karşılaştırılabilir. NM’de, işitme siniri lifleri (ANF’ler), Held terminallerinin22’sinin büyük uç ampulü aracılığıyla NM nöronlarının somatası üzerinde sinaps oluşturur. Gelişim sırasında, NM nöronları arka beyin23’teki eşkenar dörtgen 5 ve 6’dan (r5/6) kaynaklanırken, AG nöronları otokist24’te bulunan nöroblastlardan türetilir. Burada, presinaptik AG nöronlarında ve postsinaptik NM nöronlarında FMRP ekspresyonunu seçici olarak yok etme prosedürünü ayrı ayrı açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
FMRP’nin hücre özerk işlevini belirlemek için, ekspresyonunu bireysel hücre gruplarında veya hücre tiplerinde manipüle etmek gerekir. FMRP’nin ana işlevlerinden biri sinaptik oluşumu ve plastisiteyi düzenlemek olduğundan, belirli bir devrenin her bir sinaptik bileşenini seçici olarak manipüle etmek, sinaptik iletişimde FMRP mekanizmasının tam olarak anlaşılması için ön koşuldur. Tavuk embriyolarının ovo elektroporasyonunda kullanarak, AG-NM devresinde, p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma şu kişiler tarafından desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibesi (No. 32000697); Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (202102080139); Guangdong Doğa Bilimleri Vakfı (2019A1515110625, 2021A1515010619); Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (11620324); Rejeneratif Tıp Anahtar Laboratuvarı Araştırma Bursu, Eğitim Bakanlığı, Jinan Üniversitesi (No. ZSYXM202107); Çin Merkez Üniversiteleri için Temel Araştırma Fonları (21621054); ve Çin’in Guangdong Eyaleti Tıbbi Bilimsel Araştırma Vakfı (20191118142729581). Jinan Üniversitesi tıbbi deney merkezine teşekkür ederiz. Dr. Terra Bradley’e yazının dikkatli bir şekilde düzenlenmesi için teşekkür ederiz.
Materials
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
References
- Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
- Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
- Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
- Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
- Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
- Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
- Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
- Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
- Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
- Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
- Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
- Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
- Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
- Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
- Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
- Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
- Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
- Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
- Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
- Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
- Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).
