Identificando Caspases e seus motivos que clivam proteínas durante a infecção pelo vírus da gripe A
Summary
A infecção pelo vírus da gripe A (IAV) ativa as caspases que clivam o hospedeiro e as proteínas virais, que, por sua vez, têm funções pró e antivirais. Empregando-se inibidores, interferência de RNA, mutagênese sítio-dirigida e técnicas de western blotting e RT-qPCR, foram identificadas caspases em células de mamíferos infectadas que clivam a cortactina do hospedeiro e as histonas desacetilases.
Abstract
Caspases, uma família de proteases de cisteína, orquestram a morte celular programada em resposta a vários estímulos, incluindo infecções microbianas. Inicialmente descrita como ocorrendo por apoptose, a morte celular programada é agora conhecida por abranger três vias interconectadas: piroptose, apoptose e necroptose, cunhadas juntas como um processo, PANoptose. Influência A infecção por vírus (IAV) induz a PANoptose em células de mamíferos, induzindo a ativação de diferentes caspases, que, por sua vez, clivam várias proteínas hospedeiras e virais, levando a processos como a ativação da resposta antiviral inata do hospedeiro ou a degradação de proteínas antagônicas do hospedeiro. A este respeito, a clivagem mediada pela caspase 3 da cortactina do hospedeiro, histona desacetilase 4 (HDAC4) e histona desacetilase 6 (HDAC6) foi descoberta em células epiteliais animais e humanas em resposta à infecção por IAV. Para demonstrar isso, foram empregados inibidores, interferência de RNA e mutagênese sítio-dirigida e, posteriormente, a clivagem ou resistência à clivagem e a recuperação dos polipeptídeos cortactina, HDAC4 e HDAC6 foram medidas por western blotting. Esses métodos, em conjunto com a RT-qPCR, formam uma estratégia simples, mas eficaz, para identificar o hospedeiro, bem como as proteínas virais submetidas à clivagem mediada pela caspase durante uma infecção por IAV ou outros vírus humanos e animais. O presente protocolo elabora os resultados representativos dessa estratégia, e também são discutidas as formas de torná-la mais eficaz.
Introduction
O vírus da gripe A (IAV) é o membro prototípico da família Orthomyxoviridae e é conhecido por causar epidemias globais e pandemias imprevisíveis. IAV causa doença respiratória humana, gripe, comumente conhecida como “gripe”. A gripe é uma doença aguda que resulta na indução de respostas imunes inatas pró e anti-inflamatórias do hospedeiro e na morte de células epiteliais no trato respiratório humano. Ambos os processos são regidos por um fenômeno chamado morte celular programada1. A sinalização para a morte celular programada é induzida assim que vários receptores de reconhecimento de patógenos detectam as partículas virais recebidas nas células hospedeiras. Isso leva à programação da morte de células infectadas e à sinalização para as células saudáveis vizinhas por três vias interconectadas chamadas piroptose, apoptose e necroptose – recentemente cunhadas como um processo, PANoptose1.
A PANoptose envolve o processamento proteolítico de muitas proteínas hospedeiras e virais desde a indução até a execução. Esse processamento de proteínas é liderado principalmente por uma família de cisteínas proteases chamadas caspases 1,2. Até 18 caspases (da caspase 1 à caspase 18) são conhecidas3. A maioria das caspases é expressa como pró-caspases e ativada por meio de seu próprio processamento proteolítico por autocatálise ou outras caspases4 em resposta a um estímulo como uma infecção por vírus. Acreditava-se que a PANoptose de células infectadas por IAV fosse um mecanismo de defesa do hospedeiro, mas a IAV desenvolveu maneiras de evitá-la e explorá-la para facilitar sua replicação 1,2,5,6. Uma delas é antagonizar os fatores do hospedeiro por meio de clivagem ou degradação mediada por caspase que são inerentemente antivirais ou interferem em uma das etapas do ciclo de vida da IAV. Para esse fim, fatores do hospedeiro, cortactina, HDAC4 e HDAC6 foram descobertos como submetidos a clivagem ou degradação mediada por caspase em células epiteliais infectadas por IAV 7,8,9. O HDAC4 e o HDAC6 são fatores anti-IAV 8,10, e a cortactina interfere na replicação do IAV em um estágio posterior da infecção, potencialmente durante a montagem viral e brotamento 11.
Além disso, várias caspases também são ativadas, que, por sua vez, clivam múltiplas proteínas para ativar a resposta inflamatória do hospedeiro durante a infecção por IAV 1,2. Além disso, a nucleoproteína (NP), a proteína M2 do canal iônico da IAV 12,13,14 e várias proteínas de outros vírus 3,15,16 também sofrem clivagem mediada por caspase durante a infecção, o que influencia a patogênese viral. Portanto, há uma necessidade contínua de estudar a clivagem mediada pela caspase ou a degradação das proteínas do hospedeiro e virais durante a IAV e outras infecções virais para entender a base molecular da patogênese viral. Neste documento, os métodos são apresentados para (1) avaliar a clivagem ou degradação de tais proteínas por caspases, (2) identificar essas caspases e (3) localizar os locais de clivagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Está estabelecido que os vírus adaptam os fatores e vias do hospedeiro para seu benefício. Por sua vez, as células hospedeiras resistem a isso, empregando várias estratégias. Uma dessas estratégias é a PANoptosis, que as células hospedeiras usam como estratégia antiviral contra infecções por vírus. No entanto, vírus como o IAV desenvolveram suas próprias estratégias para combater a PANoptose e explorá-la a seu favor 1,3,6….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor reconhece Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), o Health Research Council of New Zealand, o Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nova Zelândia), o H.S. e J.C. Anderson Trust (Dunedin) e o Departamento de Microbiologia e Imunologia e Escola de Ciências Biomédicas (Universidade de Otago).
Materials
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
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