Het identificeren van caspasen en hun motieven die eiwitten splitsen tijdens influenza A-virusinfectie
Summary
Influenza A-virus (IAV) -infectie activeert de caspasen die gastheer en virale eiwitten splitsen, die op hun beurt pro- en antivirale functies hebben. Door gebruik te maken van remmers, RNA-interferentie, site-gerichte mutagenese en western blotting en RT-qPCR-technieken, werden caspasen geïdentificeerd in geïnfecteerde zoogdiercellen die gastheercorticonctine en histondeacetylasen splitsen.
Abstract
Caspases, een familie van cysteïneproteasen, orkestreert geprogrammeerde celdood als reactie op verschillende stimuli, waaronder microbiële infecties. Aanvankelijk beschreven als optredend door apoptose, is nu bekend dat geprogrammeerde celdood drie onderling verbonden paden omvat: pyroptose, apoptose en necroptose, samen bedacht als één proces, PANoptosis. Invloed Een virusinfectie (IAV) induceert PANoptosis in zoogdiercellen door de activering van verschillende caspasen te induceren, die op hun beurt verschillende gastheer- en virale eiwitten splitsen, wat leidt tot processen zoals de activering van de aangeboren antivirale respons van de gastheer of de afbraak van antagonistische gastheereiwitten. In dit verband is caspase 3-gemedieerde splitsing van gastheercorticactine, histondeacetylase 4 (HDAC4) en histondeacetylase 6 (HDAC6) ontdekt in zowel dierlijke als menselijke epitheelcellen als reactie op de IAV-infectie. Om dit aan te tonen, werden remmers, RNA-interferentie en plaatsgerichte mutagenese gebruikt, en vervolgens werden de splitsing of resistentie tegen splitsing en het herstel van cortactine, HDAC4 en HDAC6 polypeptiden gemeten door western blotting. Deze methoden, in combinatie met RT-qPCR, vormen een eenvoudige maar effectieve strategie om de gastheer te identificeren, evenals virale eiwitten die caspase-gemedieerde splitsing ondergaan tijdens een infectie van IAV of andere menselijke en dierlijke virussen. Het huidige protocol werkt de representatieve resultaten van deze strategie uit en de manieren om deze effectiever te maken worden ook besproken.
Introduction
Influenza A-virus (IAV) is het prototypische lid van de Orthomyxoviridae-familie en staat erom bekend wereldwijde epidemieën en onvoorspelbare pandemieën te veroorzaken. IAV veroorzaakt menselijke ademhalingsziekte, influenza, algemeen bekend als “griep”. De griep is een acute ziekte die resulteert in de inductie van gastheer pro- en anti-inflammatoire aangeboren immuunresponsen en de dood van epitheelcellen in de menselijke luchtwegen. Beide processen worden beheerst door een fenomeen dat geprogrammeerde celdood1 wordt genoemd. De signalering voor geprogrammeerde celdood wordt geïnduceerd zodra verschillende pathogeenherkenningsreceptoren de binnenkomende virusdeeltjes in gastheercellen detecteren. Dit leidt tot de programmering van de dood van geïnfecteerde cellen en signalering aan de naburige gezonde cellen door drie onderling verbonden paden genaamd pyroptose, apoptose en necroptose – onlangs bedacht als één proces, PANoptosis1.
PANoptosis omvat de proteolytische verwerking van veel gastheer- en virale eiwitten van inductie tot uitvoering. Een dergelijke verwerking van eiwitten wordt voornamelijk geleid door een familie van cysteïneproteasen genaamd caspases 1,2. Er zijn maximaal 18 caspasen (van caspase 1 tot caspase 18) bekend3. De meeste caspasen worden uitgedrukt als pro-caspasen en geactiveerd door hun eigen proteolytische verwerking te ondergaan, hetzij door autokatalyse of andere caspasen4 als reactie op een stimulus zoals een virusinfectie. De PANoptosis van IAV-geïnfecteerde cellen werd beschouwd als een gastheerverdedigingsmechanisme, maar IAV heeft manieren ontwikkeld om het te ontwijken en te exploiteren om de replicatie ervan te vergemakkelijken 1,2,5,6. Een daarvan is om de gastheerfactoren te antagoniseren via caspase-gemedieerde splitsing of afbraak die inherent antiviraal zijn of interfereren met een van de stappen van de IAV-levenscyclus. Hiertoe zijn gastheerfactoren, cortactine, HDAC4 en HDAC6 ontdekt om caspase-gemedieerde splitsing of afbraak te ondergaan in IAV-geïnfecteerde epitheelcellen 7,8,9. De HDAC4 en HDAC6 zijn anti-IAV-factoren 8,10 en cortactine interfereert met IAV-replicatie in een later stadium van infectie, mogelijk tijdens virale assemblage en ontluikende11.
Daarnaast worden ook verschillende caspasen geactiveerd, die op hun beurt meerdere eiwitten splitsen om de ontstekingsreactie van de gastheer tijdens IAV-infectie te activeren 1,2. Bovendien ondergaan nucleoproteïne (NP), ionkanaal M2-eiwit van IAV 12,13,14 en verschillende eiwitten van andere virussen 3,15,16 ook caspase-gemedieerde splitsing tijdens infectie, wat de virale pathogenese beïnvloedt. Daarom is er een voortdurende behoefte om caspase-gemedieerde splitsing of afbraak van gastheer- en virale eiwitten tijdens IAV en andere virusinfecties te bestuderen om de moleculaire basis van virale pathogenese te begrijpen. Hierin worden de methoden gepresenteerd om (1) de splitsing of afbraak van dergelijke eiwitten door caspasen te beoordelen, (2) die caspasen te identificeren en (3) de splitsingsplaatsen te lokaliseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is vastgesteld dat virussen de gastheerfactoren en -paden in hun voordeel afstemmen. Op hun beurt weerstaan de gastheercellen dat door verschillende strategieën toe te passen. Een van die strategieën is PANoptosis, die gastheercellen gebruiken als een antivirale strategie tegen virusinfecties. Virussen zoals IAV hebben echter hun eigen strategieën ontwikkeld om PANoptosis tegen te gaan en in hun voordeel te exploiteren 1,3,6</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur erkent Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, de BEI Resources (NIAID), de Health Research Council van Nieuw-Zeeland, de Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nieuw-Zeeland), de H.S. en J.C. Anderson Trust (Dunedin), en de Afdeling Microbiologie en Immunologie en School of Biomedical Sciences (Universiteit van Otago).
Materials
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -. D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
- Zheng, M., Kanneganti, T. -. D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
- Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
- Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
- Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
- Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
- Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
- Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
- Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
- Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
- Zhirnov, O. P., Klenk, H. -. D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
- Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
- Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
- Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
- Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
- Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
- Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
- Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, 160-164 (2004).
- Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
- Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, 290-297 (2015).
