تحضير الحمض النووي الريبي الطويل السيتوبلازمي والنووي من الخلايا الأولية والمستزرعة
Summary
يقدم البروتوكول الحالي طريقة فعالة ومرنة لعزل الحمض النووي الريبي من الكسور النووية والسيتوبلازمية باستخدام الخلايا المستزرعة ، ثم التحقق من صحتها باستخدام qPCR. هذا يعمل بشكل فعال كبديل لمجموعات إعداد الحمض النووي الريبي الأخرى.
Abstract
كان فصل المكونات داخل الخلايا أداة رئيسية في البيولوجيا الخلوية لسنوات عديدة حتى الآن وتمكن من توفير نظرة ثاقبة مفيدة حول كيفية تأثير موقعها على وظيفتها. على وجه الخصوص ، أصبح فصل الحمض النووي الريبي النووي والسيتوبلازمي مهما في سياق الخلايا السرطانية والسعي لإيجاد أهداف جديدة للأدوية. يمكن أن يكون شراء مجموعات لاستخراج الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي النووي مكلفا عندما يمكن العثور على العديد من المواد المطلوبة في بيئة معملية نموذجية. باستخدام الطريقة الحالية ، التي يمكن أن تحل محل مجموعات أكثر تكلفة أو غيرها من العمليات التي تستغرق وقتا طويلا ، لا يلزم سوى مخزن مؤقت محلي الصنع ، وأجهزة طرد مركزي على الطاولة ، وأعمدة تنقية عزل الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي والسيتوبلازمي. يستخدم المخزن المؤقت للتحلل لتحلل الغشاء الخارجي للخلية برفق دون التأثير على سلامة الغلاف النووي ، مما يسمح بإطلاق مكوناته داخل الخلايا. بعد ذلك، يمكن عزل النوى عن طريق خطوة طرد مركزي بسيطة؛ لأنها تحتوي على كثافة أعلى من محلول التحلل. يستخدم الطرد المركزي لفصل هذه المناطق بناء على اختلافات كثافتها لعزل العناصر تحت الخلوية في النواة عن تلك الموجودة في السيتوبلازم. بمجرد أن يقوم الطرد المركزي بعزل المكونات المختلفة ، يتم استخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي لتنقية محتوى الحمض النووي الريبي ، ويتم إجراء qPCR للتحقق من جودة الفصل ، ويتم تحديدها كميا بكمية الحمض النووي الريبي والسيتوبلازمي في الأجزاء المختلفة. تم تحقيق مستويات ذات دلالة إحصائية من الفصل ، مما يوضح فعالية البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف هذا النظام لعزل أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي (الكلي ، الحمض النووي الريبي الصغير ، إلخ) ، مما يسمح بالدراسة المستهدفة لتفاعلات السيتوبلازم والنواة ، ويساعد في فهم الاختلافات في وظيفة الحمض النووي الريبي الموجودة في النواة والسيتوبلازم.
Introduction
يسمح التجزئة الخلوية إلى مكونات دون خلوية بعزل ودراسة المجالات البيوكيميائية المحددة ويساعد في تحديد توطين عمليات خلوية محددة وكيف يمكن أن يؤثر ذلك على وظيفتها1. يمكن أن يسمح عزل الحمض النووي الريبي من مواقع مختلفة داخل الخلايا بتحسين دقة التحليل الجيني والكيميائي الحيوي لأحداث مستوى النسخ والتفاعلات الأخرى بين النواة والسيتوبلازم ، والتي تعمل كغرض أساسي للبروتوكولالحالي 2. تم تطوير هذا البروتوكول لضمان عزل الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي والنووي لتحديد دور كل منهما في التصدير النووي وفهم كيفية تأثير توطين الحمض النووي الريبي تحت الخلوي في النواة والسيتوبلازم على وظيفتها في العمليات الخلوية. وباستخدام مواد من بيئة مختبرية نموذجية، كان من الممكن تحقيق التجزئة النووية والسيتوبلازمية على نحو أكثر فعالية وأقل تكلفة من البروتوكولات الموضوعة سابقا دون المساس بجودة النتائج3.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة تبادل الجزيئات بين السيتوبلازم والنواة مباشرة عن طريق فصل هذه المناطق. وبشكل أكثر تحديدا ، يعد فهم النسخ أمرا ضروريا لفهم التطور والمرض. ومع ذلك ، قد تكون الحمض النووي الريبي عند مستويات نضج مختلفة في أي وقت ويمكن أن تعقد تحليل المصب. يسمح هذا البروتوكول بالقدرة على عزل الحمض النووي الريبي من الكسور تحت الخلوية النووية والسيتوبلازمية ، والتي يمكن أن تساعد في دراسات الحمض النووي الريبي وتسمح بفهم أفضل لحمض نووي ريبوزي معين ذي أهمية ، مثل توطين الحمض النووي الريبي غير المشفر أو تحليل تقاطعات لصق داخل النواة.
تم تحسين هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي الطويل السيتوبلازمي والنووي ، بما في ذلك mRNAs و rRNAs و RNAs الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) ، نظرا لانتقائية حجم عمود تنقية الحمض النووي الريبي المستخدم ، والذي يمكن تعديله لعزل الحمض النووي الريبي الآخر ذي الأهمية. في السابق ، كانت وظيفة الحمض النووي الريبي الطويل ، مثل mRNAs و lncRNAs ، تعتمد بشكل كبير على توطين كل منها داخل الخلية 4,5. لذلك ، أصبحت دراسة التصدير من النواة إلى المجالات دون الخلوية أكثر استهدافا لفهم الدور الذي يمكن أن يلعبه تصدير الحمض النووي الريبي أو المكونات الخلوية الأخرى على الخلية. تعمل lncRNAs كمثال رئيسي على ذلك ، حيث تعتمد ترجمتها وآثارها اللاحقة إلى حد كبير على القرب والتفاعلات مع أشكال أخرى من RNA6. علاوة على ذلك ، يرتبط تبادل العناصر الخلوية بين المناطق النووية والسيتوبلازمية بآليات المقاومة لمختلف علاجات السرطان7. سمح عزل المقصورات داخل الخلايا بتطوير مثبطات التصدير النووي ، مما قلل من آثار آليات المقاومة للعلاجات المختلفة8.
بعد فصل الحمض النووي الريبي النووي والسيتوبلازمي ، يتم تنفيذ خطوات لتنقية الحمض النووي الريبي محل الاهتمام. نظرا لأن مجموعات تنقية الحمض النووي الريبي توجد بشكل شائع داخل المختبرات وتعمل على تنقية وعزل الحمض النووي الريبي الطويل ، فإنها تخدم الغرض من هذا البروتوكول جيدا. لتنقية الحمض النووي الريبي ، يعد توليد نسب 260: 280 أكبر من 1.8 أمرا بالغ الأهمية لضمان جودة العينات لتسلسل الحمض النووي الريبي أو غيرها من الإجراءات المماثلة التي تتطلب مستويات عالية من النقاء والعزل. تشير القيم غير المنتظمة 260: 280 إلى تلوث الفينول ، مما يدل على ضعف العزل ويؤدي إلى نتائج غير دقيقة9.
بمجرد اكتمال تنقية الحمض النووي الريبي وتأكيد أن قيم 260: 280 أعلى من النطاق المقبول ، تم استخدام qPCR للتحقق من صحة نتائج عزل الكسور النووية والسيتوبلازمية. عند القيام بذلك ، تم استخدام الاشعال الخاصة بالمنطقة ذات الاهتمام لإثبات مستويات التجزئة النووية والسيتوبلازمية. في هذا البروتوكول ، تم استخدام MALAT1 و TUG1 كعلامات نووية وسيتوبلازمية ، على التوالي10. معا ، فإنها تسمح بإظهار مستويات عالية من التجزئة النووية مع MALAT1 ، في حين من المتوقع أن تكون التجزئة السيتوبلازمية منخفضة. على العكس من ذلك ، عند استخدام TUG1 ، من المتوقع أن تكون مستويات التجزئة السيتوبلازمية أعلى من مستويات التجزئة النووية.
باستخدام هذا البروتوكول ، كان من الممكن عزل الحمض النووي الريبي بناء على موقع عملها داخل الخلية. نظرا للوصول الواسع النطاق إلى العديد من المواد واستخدام المخزن المؤقت للتحلل فقط وتقنيات الطرد المركزي القائمة على الكثافة خلال هذه التجربة ، فإن قابلية التطبيق على أنواع الحمض النووي الريبي الأخرى والمكونات الخلوية الأخرى منتشرة على نطاق واسع. يمكن أن يوفر هذا معلومات مهمة من خلال تسليط الضوء على أحداث التعبير الخاصة بالموقع والتي لا يمكن تمييزها بدون فصل.
Protocol
Representative Results
Discussion
في جميع أنحاء البروتوكول ، تم اتخاذ بعض الخطوات لتحسين العناصر لتكون أكثر فعالية لخط اهتمام الخلية. في حين أن الخطوات داخل البروتوكول واضحة نسبيا ، فقد يكون من الضروري إجراء تحليل وتعديلات طفيفة خلال الجوانب الحرجة للبروتوكول. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي تعديل تركيز المخزن المؤ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من منح من الجمعية الأمريكية لأمراض الدم ، ومؤسسة روبرت وود جونسون ، ومؤسسة دوريس ديوك الخيرية ، ومؤسسة إدوارد بي إيفانز ، والمعهد الوطني للسرطان (1K08CA230319).
Materials
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
References
- Conrad, T., Orom, U. A. Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA. Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).
- Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. RNA localization in development. Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).
- Liu, X., Fagotto, F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Science Signaling. 4 (203), (2011).
- Jansen, R. P. mRNA localization: message on the move. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).
- Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization. Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).
- Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. 150 years of the mass action law. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012 (2015).
- El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy. Cancers (Basel). 8 (3), 35 (2016).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer). Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).
- Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting. Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
- Taylor, J., et al. Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis. Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).
- Ayupe, A. C., et al. Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome. RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).
- Ghuysen, J. -. M., Hakenbeck, R. . Bacterial Cell Wall. , (1994).
- Fersht, A. . Enzyme Structure and Mechanism. , (1985).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to win the battle with RNase. 2019 (2), (2019).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).
- Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. , (2006).
- Taylor, J., et al. Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents. Blood. 132, 233 (2018).
