Den nåværende protokollen tilbyr en effektiv og fleksibel metode for å isolere RNA fra nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner ved bruk av dyrkede celler, og deretter validere ved hjelp av qPCR. Dette fungerer effektivt som en erstatning for andre RNA-forberedelsessett.
Separasjonen av intracellulære komponenter har vært et sentralt verktøy i cellebiologi i mange år nå, og har vært i stand til å gi nyttig innsikt i hvordan deres plassering kan påvirke deres funksjon. Spesielt har separasjonen av nukleært og cytoplasmatisk RNA blitt viktig i sammenheng med kreftceller og søken etter å finne nye mål for medisiner. Innkjøpssett for kjernefysisk-cytoplasmatisk RNA-ekstraksjon kan være kostbart når mange av de nødvendige materialene finnes i en typisk laboratorieinnstilling. Ved å bruke den nåværende metoden, som kan erstatte dyrere sett eller andre tidkrevende prosesser, er det bare nødvendig med en hjemmelaget lysisbuffer, en stasjonær sentrifuge og RNA-isolasjonsrensingskolonner for å isolere nukleært og cytoplasmatisk RNA. Lysisbuffer brukes til å forsiktig lyse cellens ytre membran uten å påvirke integriteten til den nukleære konvolutten, noe som gjør det mulig å frigjøre sine intracellulære komponenter. Deretter kan kjernene isoleres ved et enkelt sentrifugeringstrinn siden de har en høyere tetthet enn lysisløsningen. Sentrifugering benyttes til å skille disse områdene basert på deres tetthetsforskjeller for å isolere subcellulære elementer i kjernen fra de i cytoplasma. Når sentrifugeringen har isolert de forskjellige komponentene, brukes et RNA-oppryddingssett for å rense RNA-innholdet, og qPCR utføres for å validere separasjonskvaliteten, kvantifisert av mengden nukleært og cytoplasmatisk RNA i de forskjellige fraksjonene. Statistisk signifikante nivåer av separasjon ble oppnådd, noe som illustrerer protokollens effektivitet. I tillegg kan dette systemet tilpasses for isolering av forskjellige typer RNA (totalt, lite RNA, etc.), noe som muliggjør målrettet studie av cytoplasma-kjerneinteraksjoner, og hjelpemidler til å forstå forskjellene i funksjonen til RNA som ligger i kjernen og cytoplasma.
Cellulær fraksjonering i subcellulære komponenter muliggjør isolering og studier av definerte biokjemiske domener og hjelpemidler for å bestemme lokaliseringen av spesifikke cellulære prosesser og hvordan dette kan påvirke deres funksjon1. Isolering av RNA fra forskjellige intracellulære steder kan muliggjøre forbedret nøyaktighet av genetisk og biokjemisk analyse av transkripsjonsnivåhendelser og andre interaksjoner mellom kjernen og cytoplasma, som tjener som hovedformålet med gjeldende protokoll2. Denne protokollen ble utviklet for å sikre isolering av cytoplasmatiske og nukleære RNA for å bestemme deres respektive roller i kjernefysisk eksport og for å forstå hvordan subcellulær lokalisering av RNA i kjernen og cytoplasma kan påvirke deres funksjon i cellulære prosesser. Ved å bruke materialer fra en typisk laboratorieinnstilling var det mulig å oppnå nukleær og cytoplasmatisk fraksjonering mer effektivt og billigere enn tidligere etablerte protokoller uten å sette kvaliteten på resultatene i fare3.
I tillegg kan utvekslingen av molekyler mellom cytoplasma og kjernen studeres direkte ved å separere disse områdene. Mer spesifikt er forståelse av transkriptomet avgjørende for å forstå utvikling og sykdom. Imidlertid kan RNA være på forskjellige modningsnivåer til enhver tid og kan komplisere nedstrøms analyse. Denne protokollen tillater muligheten til å isolere RNA fra nukleære og cytoplasmatiske subcellulære fraksjoner, noe som kan hjelpe til med studier av RNA og muliggjøre en bedre forståelse av et bestemt RNA av interesse, for eksempel lokalisering av ikke-kodende RNA eller analyse av spleisekryss i kjernen.
Denne protokollen er optimalisert for å isolere cytoplasmatiske og nukleære lange RNAer, inkludert mRNAer, rRNA og lange ikke-kodende RNA (lncRNAer), på grunn av størrelsesselektiviteten til RNA-rensingskolonnen som brukes, som kan modifiseres for å isolere andre RNA av interesse. Tidligere var funksjonen til lange RNAer, som mRNA og lncRNA, sterkt avhengig av deres respektive lokalisering i cellen 4,5. Derfor har studiet av eksporten fra kjernen til subcellulære domener blitt mer målrettet mot å forstå hvilken rolle eksport av RNA eller andre cellulære komponenter kan ha på cellen. lncRNA tjener som et godt eksempel på dette, da deres oversettelse og påfølgende effekter i stor grad er avhengige av nærhet og interaksjoner med andre former for RNA6. Videre er utveksling av cellulære elementer mellom nukleære og cytoplasmatiske regioner knyttet til resistensmekanismer mot ulike kreftbehandlinger7. Isoleringen av intracellulære rom har gjort det mulig å utvikle kjernefysiske eksporthemmere, noe som har redusert effekten av resistensmekanismer mot forskjellige terapier8.
Etter separering av nukleært og cytoplasmatisk RNA utføres trinn for å rense RNA av interesse. Siden RNA-rensesett ofte finnes i laboratorier og fungerer for å rense og isolere lange RNA, tjener de formålet med denne protokollen godt. For RNA-rensing er generering av 260: 280-forhold større enn 1,8 avgjørende for å sikre kvaliteten på prøver for RNA-sekvensering eller andre lignende prosedyrer som krever høye nivåer av renhet og isolasjon. Uregelmessige 260:280-verdier indikerer fenolforurensning, noe som viser dårlig isolasjon og gir unøyaktige resultater9.
Når RNA-rensingen er fullført og 260:280-verdiene er bekreftet å være over et akseptabelt område, ble qPCR brukt til å validere isolasjonsresultatene av nukleære og cytoplasmatiske fraksjoner. Ved å gjøre dette ble primere som var spesifikke for interesseområdet brukt til å demonstrere nukleære og cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer. I denne protokollen ble MALAT1 og TUG1 brukt som henholdsvis nukleære og cytoplasmatiske markører10. Sammen tillater de demonstrasjon av høye nivåer av nukleær fraksjonering med MALAT1, mens cytoplasmatisk fraksjonering forventes å være lav. Omvendt, når TUG1 brukes, forventes cytoplasmatiske fraksjoneringsnivåer å være høyere enn nukleære fraksjoneringsnivåer.
Ved hjelp av denne protokollen var det mulig å isolere RNA basert på deres virkningsposisjon i cellen. På grunn av utbredt tilgang til mange materialer og utnyttelse av bare lysisbuffer og tetthetsbaserte sentrifugeringsteknikker under dette eksperimentet, er anvendelighet for andre RNA-typer og andre cellulære komponenter utbredt. Dette kan gi viktig informasjon ved å belyse stedsspesifikke uttrykkshendelser som ellers ikke ville kunne skilles uten separasjon.
Gjennom protokollen ble det tatt noen skritt for å optimalisere elementene for å være mest effektive for cellelinjen av interesse. Selv om trinnene i protokollen er relativt enkle, kan analyse og mindre justeringer under kritiske aspekter av protokollen være nødvendig. Det mest kritiske trinnet i protokollen er å endre konsentrasjonen av lysisbufferen til en riktig konsentrasjon basert på cellelinjen av interesse og det cellulære målet. Siden utnyttelsen av lysisbuffer i stor grad avhenger av forstyrrelsen av ce…
The authors have nothing to disclose.
Støttet av tilskudd fra American Society of Hematology, Robert Wood Johnson Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Edward P. Evans Foundation og National Cancer Institute (1K08CA230319).
Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |