Dette er en vanlig metode for C. elegans gonad disseksjon etterfulgt av fryse sprekk, som produserer germline prøver for immunfluorescens via antistofffarging, eller for enkel DAPI farging for å visualisere DNA. Denne protokollen har vært vellykket for studenter i et forskningslaboratorium og i en kursbasert grunnforskningserfaring.
C. elegans germline er en utmerket modell for å studere meiose, delvis på grunn av det enkle å gjennomføre cytologiske analyser på dissekerte dyr. Hele monteringspreparater bevarer strukturen til meiotiske kjerner, og viktigere, hver gonadarm inneholder alle stadier av meiose, organisert i en temporal-romlig progresjon som gjør det enkelt å identifisere kjerner på forskjellige stadier. Voksne hermafroditter har to gonadarmer, hver organisert som et lukket rør med prolifererende germline stamceller i den distale lukkede enden og cellulariserte oocytter i den proksimale åpne enden, som går sammen i midten ved livmoren. Disseksjon frigjør en eller begge gonadarmene fra kroppshulen, slik at hele meiose kan visualiseres. Her presenteres en felles protokoll for immunfluorescens mot et protein av interesse, etterfulgt av DAPI-farging for å markere alle kromosomer. Unge voksne immobiliseres i levamisol og dissekeres raskt ved hjelp av to sprøytespisser. Etter germline ekstrudering blir prøven løst før den gjennomgår en frysesprekk i flytende nitrogen, noe som hjelper til med å permeabilisere neglebåndet og andre vev. Prøven kan deretter dehydreres i etanol, rehydreres og inkuberes med primære og sekundære antistoffer. DAPI legges til prøven i monteringsmediet, noe som muliggjør pålitelig visualisering av DNA og gjør det enkelt å finne dyr å avbilde under et fluorescerende mikroskop. Denne teknikken er lett vedtatt av de som er kjent med håndtering av C. elegans etter noen timer brukt på å praktisere disseksjonsmetoden selv. Denne protokollen har blitt undervist til videregående skoleelever og studenter som arbeider i et forskningslaboratorium og innlemmet i en kursbasert grunnforskningserfaring ved en liberal arts college.
Meiose er den spesialiserte celledelingen som brukes til å lage kjønnsceller (egg og sæd/pollen) i alle seksuelt reproduserende organismer 1,2. Crossover rekombinasjon er gjensidig utveksling av DNA mellom homologe kromosomer; Det er viktig for meiose, både å gi en viktig kilde til genetisk mangfold og fremme genomstabilitet gjennom generasjoner. Kromosomer som ikke klarer å danne minst en crossover under meiose, vil segregere tilfeldig, noe som kan resultere i kromosom nondisjunction, og skape gameter med feil antall kromosomer – en tilstand som vanligvis er dødelig for resulterende avkom3. Under meiose induseres crossovers av programmerte dobbeltstrengede DNA-brudd4. En delmengde av disse pausene vil bli reparert som crossovers som gir fysiske koblinger av DNA, kalt chiasmata, som hjelper til med å orientere homologe kromosomer som forberedelse til celledeling5. Meiotiske stadier er svært konservert over alle eukaryoter, og deres kromosomale konformasjon gjør at de lett kan identifiseres.
Som et grunnleggende konsept i biologi er meiose et tema som studentene møter flere ganger i ulike biologikurs. De blir ofte introdusert til mekanikken i meiotisk kromosomsegregering i videregående skole, mens kurs på høyskolenivå fokuserer på cellebiologi av segregering og den genetiske effekten av crossover-rekombinasjon. Meiose er imidlertid et notorisk vanskelig konsept for mange studenter1. En manglende forståelse av forholdet mellom gener, DNA, kromosomer og meiose kan generere student misforståelser og hull i forståelse som hindrer en full forståelse av genetisk arv 6,7. En måte å forbedre studentens forståelse av abstrakte emner er å gi konkrete, praktiske aktiviteter. For eksempel, når de underviser i meiose, kan instruktører velge mellom aktiviteter som emulerer molekylær analyse8, 3D-modeller som lar elevene manipulere molekyler9, eller rollespill der studentene selv spiller ut molekylær koreografi1. Å inkorporere forskning med ukjente utfall er en spesielt effektiv måte å forbedre studentforståelsen på. Denne praksisen er kjent som en kursbasert grunnforskningserfaring (CURE) og har den ekstra fordelen av å styrke studentenes holdninger og handlefrihet, spesielt for de som tilhører grupper som fortsatt er underrepresentert i STEM10,11. Nematodeormen Caenorhabditis elegans er spesielt egnet for klasseromsstudier av atferd, fruktbarhet og genetiske kryss, og er en effektiv modell for å introdusere studenter til biologisk forskning12.
C. elegans lager en kraftig modellorganisme for cellebiologi ved å kombinere molekylær genetikk med enkel cytologisk analyse. Det er også spesielt godt egnet for bruk i en biologi klasserom 13,14,15. De er enkle og økonomiske å vedlikeholde i et laboratorium, og produserer hundrevis av avkom hver 3. dag, både ved standard romtemperatur eller ved 20 ° C, den vanligste inkubasjonstemperaturen. Det er viktig at de kan fryses som glyserollagre og oppbevares i en fryser på -80 °C, noe som betyr at eventuelle oppdrettsfeil gjort av nybegynnere lett kan korrigeres16. Videre tillater det godt kommenterte genomet fremover og reverserer genetiske teknikker17,18, slik at C. elegans kan brukes til å løse biologiske spørsmål som spenner fra molekylær til evolusjonær. Endelig har C. elegans forskere skapt et støttende samfunn som ofte er villig til å gi hjelp og råd til spirende forskere19. Disse fordelene har ført til at C. elegans har blitt innlemmet i en rekke CUREs ved ulike typer institusjoner 12,19,20,21,22,23.
I tillegg til fordelene for forskning og undervisning, har C. elegans blitt en populær modell for studier av meiose og germline utvikling24,25,26. Den optiske klarheten til disse dyrene forenkler cytologiske tilnærminger27, og hos voksne representerer gonader nesten halvparten av dyret, og gir hundrevis av meiotiske celler å studere. I gonader er meiotiske kimlinjekjerner arrangert som et samlebånd (figur 1); Mitotisk replikasjon skjer ved den distale spissen av gonaden, med kjerner som utvikler seg gjennom meiotiske stadier når de migrerer mot den proksimale enden av gonaden, hvor befruktede embryoer kommer fra vulva. Fordi den stereotype romlige organisasjonen også representerer en tidsmessig progresjon gjennom meiose, kan forskjellige stadier lett identifiseres basert på deres kromosomale organisasjon og plassering i gonaden. Til slutt skaper prosesser som forstyrrer meiose og forårsaker aneuploidi fenotyper som er enkle å karakterisere, selv for nybegynnere: sterilitet, embryonal dødelighet eller høy forekomst av menn (Him fenotype)28.
Dette er en enkel protokoll for å visualisere meiotiske kromosomer i C. elegans. Montering, disseksjon, festing og antistofffarging utføres alle på samme mikroskopglid, noe som forenkler protokollen og tillater nesten perfekt prøvegjenoppretting. Denne metoden fungerer for enkel DAPI-farging for å visualisere kromosomer og kan brukes til immunfluorescens for å visualisere lokalisering av proteiner i gonaden. Studentene dissekerer gonader ved hjelp av grunnleggende dissekeringsmikroskoper, genererer helmonterte preparater for visualisering av DNA eller immunfluorescens, og avbilder dem på et sammensatt fluorescerende mikroskop. Denne protokollen har blitt undervist til videregående studenter og studenter som arbeider i et C. elegans forskningslaboratorium og innlemmet i en CURE på en liberal arts college12. Selv om CURE hadde en relativt liten klassestørrelse, ville denne protokollen være egnet for klasser ved en rekke institusjoner på grunn av den relativt lave prisen på ormstammer og reagenser. Instruktører vil bare være begrenset av antall dissekeringsmikroskoper som er tilgjengelige for bruk. Den forrige implementeringen hadde studenter som jobbet i grupper på tre for å dele et enkelt mikroskop og fant sted over tre 90-minutters økter: den første til å øve disseksjon, den andre til å implementere disseksjon og DAPI-farging, og den tredje til bildelysbilder på et bredfeltfluorescensmikroskop. Deltakelse i grunnforskning gir mange fordeler for studenter11,29, både faglig og personlig. Embedding forskning i kurs via CUREs tillater elevene å delta i forskning i løpet av normal klassetid11,30,31, noe som gjør eksponering for disse fordelene mer tilgjengelig og rettferdig.
Seksuell reproduksjon krever opprettelse av haploide gameter, som produseres via spesialisert celledeling av meiose. C. elegans har blitt en populær modell for cytologisk studie av meiose på grunn av sin optiske gjennomsiktighet, praktisk germline anatomi og kraftig genetikk28. Enkle organismeeksperimenter som vurderer fruktbarhet og embryonal dødelighet kan kombineres med molekylær genetikk for å løse mange spørsmål i laboratoriet eller klasserommet. For eksempel, fordi crossovers er avgjørende for riktig kromosomsegregering, vil prosesser som forstyrrer dannelsen eller oppløsningen generere aneuploide kjønnsceller. I sin tur fører aneuploidi til misunnelsesverdig avkom, som lett kan vurderes ved å telle avkom, eller gjennom den litt mer kompliserte metoden for å bestemme embryonal dødelighet. Cytologisk vil mangel på overganger påvirke antall DAPI-fargingslegemer observert under diakinese. Robustheten til DAPI-farging og den enkle scoringen gjør dette til et ideelt eksperiment for å lære cytologiske teknikker. Den temporale-romlige utformingen av kjerner i hermafroditt-kimlinjen gir et øyeblikksbilde av hvert stadium av meiose på et enkelt tidspunkt. Kjerner tar omtrent 54 timer å fortsette fra den distale mitotiske enden av kimlinjen til den proksimale enden (for eksempler, se Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 og Libuda et al.35). Denne veletablerte timingen av meiotisk fremgang muliggjør pulsjaktmerking eller DNA-skadelige eksperimenter.
Fordi DAPI-farging nesten alltid fungerer, fungerer det som en nyttig teknisk kontroll for fluorescensmikroskopi (og kan gi tilfredsstillelse for mikroskopister i trening). Antistofffarging kan være mer variabel og er et godt mål på reproduserbarhet mellom replikasjoner. C.elegans gonader kan være vanskelig å fikse konsekvent, da dette trinnet krever en balanse mellom å bevare kromosomal struktur samtidig som det tillater nok antistoffdiffusjon. Festing med formaldehyd bevarer best kromosomal morfologi, og tilberedning av formaldehyd frisk fra paraformaldehydampuller har gitt de mest reproduserbare resultatene. Det er også mulig å bruke formaldehyd fremstilt av formalin (37% vandig formaldehyd og metanol). Fikseringsstyrke og timing må kanskje bestemmes empirisk for hvert antistoff. Alternative metoder innebærer å hoppe over formaldehydfikseringen i trinn 2.4 og, etter frysesprekk, nedsenking i 100% etanol ved -20 ° C, eller nedsenking i 100% metanol i 10 minutter etterfulgt av nedsenking i 100% aceton i 10 minutter ved -20 ° C. Disse fikseringsforholdene tillater bedre antistoffpenetrasjon, men vil påvirke vevsmorfologien negativt (kromosomer vil se utblåst og puffier ut).
Timing er svært viktig for disseksjon og fikse trinnene som er skissert i trinn 2. Fordi volumet av disseksjonsoppløsning er så lite, kan fordampning påvirke den endelige fikseringskonsentrasjonen, noe som vil forårsake variabel antistofffarging. En erfaren C. elegans handler kan forberede et lysbilde på mindre enn 2 minutter fra starten (trinn 2.3) for å fikse (trinn 2.4). Den viktigste tekniske hindringen er evnen til å plukke dyr i dråpen av disseksjonsløsning og raskt dissekere dem. Det kan være lettere å lære å dissekere i større volumer. Nye praktikanter starter først med å plukke dyr i 50-200 μL disseksjonsløsning i en glassembryofargingsfat (figur 2D); Den bredere overflaten gir mer handlingsrom når du identifiserer en ideell nålposisjon for gode gonadprofiler, mens det større volumet av væske gjør fordampning mindre av et problem. Når de er komfortable med bevegelsene til dissekering, begynner praktikanter å dissekere med bare 50 μL i parabolen, og bytter deretter til dissekering i 20 μL på et lysbilde. Når de er dissekert på lysbilder, kan praktikanter raskt begynne å redusere mengden løsning til de er raske nok til å jobbe i 4 μL for å gjøre fordampning ubetydelig.
Hvis tidspunktet for disseksjon forblir et problem, kan praktikanter dissekere i 8 μL av disseksjonsløsningen i trinn 2.3. Deretter, i trinn 2.4, kan de tilsette 8 μL av fiksløsningen, forsiktig pipettere for å blande grundig (se nøye på at ikke blir forstyrret eller pipettert bort), og fjerne 8 μL fra den blandede løsningen. Denne alternative tilnærmingen vil resultere i samme sluttvolum på 8 μL og samme endelige fikseringskonsentrasjon; Dette volumet er viktig for å sikre at kommer i kontakt med både dekselet og glideflaten under frysesprekken i trinn 2.5. Hvis tidspunktet for å forberede hvert lysbilde forblir et problem selv i større disseksjonsvolumer, er en suspensjonsmetode for germline immunofluorescensprotokoll beskrevet av Gervaise og Arur26.
Den største begrensningen ved bruk av immunfluorescens for å visualisere proteiner in situ er tilgjengeligheten av primære antistoffer rettet mot et bestemt protein av interesse. Men hvis en merket versjon av proteinet er konstruert, kan denne protokollen tilpasses for å visualisere proteinkoden. Antistoffer rettet mot vanlige koder, som FLAG, HA eller GFP, er ofte tilgjengelige. Fluorescerende koder som GFP kan ofte slukkes av fikseringstrinn, så det anbefales å bruke et primært antistoff rettet mot GFP, i stedet for å stole på det opprinnelige fluorescenssignalet selv. En annen begrensning av denne protokollen er at den fanger kimlinjen innen en enkelt tidsramme (selv om alle stadier av oogenese vil bli representert i kimlinjen). Derfor kan denne teknikken savne dynamiske endringer som kan oppstå når en oocyt utvikler seg gjennom oogenese. Imidlertid har tidspunktet for gametogenese blitt godt studert i C. elegans; I en villtype ung voksen tar en oocyt ca. 60 timer å utvikle seg fra den distale spissen av kimlinjen (den mitotiske sonen) til diakinesis33. Derfor vil en pulsjakt eller spesifikk intervensjon som bestråling etterfulgt av et tidsforløp tillate observasjon av effekter på forskjellige stadier av meiose.
Avslutningsvis beskriver denne protokollen C. elegans gonaddisseksjon etterfulgt av DAPI og antistofffarging for fluorescensmikroskopi. Disseksjon og fiksering (trinn 2) tar 60-90 minutter, avhengig av antall lysbilder som genereres. Antistofffarging (trinn 3) er for det meste hands-off og kan variere fra 7 timer på minimum til 1,5 dager, avhengig av antistoff inkubasjon ganger. Montering (trinn 4,1-4,7) tar ca. 15 min. Denne generelle tilnærmingen til å visualisere germline kromosomer og gonaden kan brukes til cytologiske studier av noe protein hvis et antistoff eller fluorescerende tag reagens eksisterer. I sin enkleste form kan DAPI-farging av diakinesekjerner brukes til å skjerme for faktorer som påvirker meiotisk rekombinasjon. Sammen med organismeanalyser av avkomtall, forekomst av hanner (He-fenotype) og embryonal letalitet, gir denne cytologiske tilnærmingen et encellet kontrapunkt til populasjonsbaserte analyser.
The authors have nothing to disclose.
Arbeid i Lee-laboratoriet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences under prisnummer 1R15GM144861 og National Institute for Child and Human Development under prisnummer 1R15HD104115, begge av National Institutes of Health. DA ble støttet av UML Kennedy College of Sciences Science Scholars-programmet. NW ble støttet av et UML Honors College Fellowship og et UMLSAMP-fellesskap (finansiert av National Science Foundation under tilskuddsnummer HRD-1712771). Vi takker A. Gartner for RAD-51 antistoff. Alle C. elegans stammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center, som er finansiert av Office of Research Infrastructure Programs of the National Institutes of Health under tildelingsnummerP40 OD010440.
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | Molecular Probes | 711-545-152 | |
Aluminum heating/cooling block | Millipore Sigma | Z743497 | |
Bacto Peptone | Gibco | DF0118 17 0 | |
Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches | Fisherbrand | 13 678 20B | Used to make worm picks |
BSA, Bovine Serum Albumin | VWR | 97061 420 | |
C. elegans wild type (ancestral) | Caenorhabditis Genetics Center | N2 (ancestral) | |
C. elegans kle-2 (ok1151) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | VC768 | The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants. |
C. elegans spo-11 (me44) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | TY4342 | The full genotype of this strains is: spo-11(me44) IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants. |
Calcium Chloride Anhydrous | VWR | 97062 590 | |
Cholesterol | Sigma Aldrich | 501848300 | |
DAPI | Life Technologies | D1306 | |
EDTA, Disodium Dihydrate Salt | Apex Bioresearch Products | 20 147 | |
Embryo Dish, glass, 30mm cavity | Electron Microscopy Services | 100492-980 | Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic |
Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
Food storage container, plastic | various | n/a | Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred |
Glass Coplin Jar | DWK Life Sciences Wheaton | 08-813E | |
Hydrophobic Barrier PAP Pen | ImmEdge | NC9545623 | |
Kimwipes | Kimtech Science | 06 666A | |
Levamisole Hydrochloride | Sigma Aldrich | L0380000 | |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Fisher Chemical | M65 500 | |
Needles, Single-use, 25 G | BD PrecisionGlide | 14 821 13D | blue, 1 inch |
NGM Agar, Granulated | Apex Bioresearch Products | 20 249NGM | |
Parafilm | Bemis | 16 101 | |
Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 50 980 487 | |
PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) | Fisher BioReagents | BP399500 | |
Petri Dishes, 60-mm | Tritech Research | NC9321999 | Non-vented, sharp edge |
Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) | Tritech Research | PT 9010 | Used to make worm picks |
Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
Potassium Phosphate Dibasic | VWR BDH Chemicals | BDH9266 500G | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR BDH Chemicals | BDH9268 500G | |
Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm | Fisherbrand | 12-548-AP | 0.13–0.17 mm thickness |
Razor Blades, Single Edge | VWR | 55411 055 | |
SlowFade Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | S36937 | Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging. |
Sodium Azide | Fisher BioReagents | BP922I 500 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Sigma Aldrich | 7558 79 4 | |
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Sigma Aldrich | S9390 | |
Styrofoam box | various | n/a | Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 22 037 246 | |
Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 500 | |
Tryptone | Apex Bioresearch Products | 20 251 | |
Tween 20 | Fisher Chemical | BP337 500 | |
Yeast Extract | Apex Bioresearch Products | 20 254 |