Adskillelse af immuncelleunderpopulationer i perifere blodprøver fra børn med infektiøs mononukleose
Summary
Vi beskriver en metode, der kombinerer immunmagnetiske perler og fluorescensaktiveret cellesortering for at isolere og analysere definerede immuncelleunderpopulationer af mononukleære celler i perifert blod (monocytter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og naturlige dræberceller). Ved hjælp af denne metode kan magnetiske og fluorescerende mærkede celler renses og analyseres.
Abstract
Infektiøs mononukleose (IM) er et akut syndrom, der hovedsagelig er forbundet med primær Epstein-Barr-virus (EBV) infektion. De vigtigste kliniske symptomer omfatter uregelmæssig feber, lymfadenopati og signifikant øgede lymfocytter i perifert blod. Den patogene mekanisme for IM er stadig uklar; Der er ingen effektiv behandlingsmetode til det, hvor hovedsageligt symptomatiske terapier er tilgængelige. Hovedspørgsmålet i EBV-immunbiologi er, hvorfor kun en lille delmængde af inficerede individer viser alvorlige kliniske symptomer og endda udvikler EBV-associerede maligniteter, mens de fleste individer er asymptomatiske for livet med virussen.
B-celler er først involveret i IM, fordi EBV-receptorer præsenteres på deres overflade. Naturlige dræberceller (NK) er cytotoksiske medfødte lymfocytter, der er vigtige for at dræbe EBV-inficerede celler. Andelen af CD4 + T-celler falder, mens CD8 + T-celler udvides dramatisk under akut EBV-infektion, og persistensen af CD8 + T-celler er vigtig for livslang kontrol af IM. Disse immunceller spiller vigtige roller i IM, og deres funktioner skal identificeres separat. Til dette formål adskilles monocytter først fra perifere blodmononukleære celler (PBMC’er) af IM-individer ved hjælp af CD14-mikroperler, en søjle og en magnetisk separator.
De resterende PBMC’er er farvet med peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5,5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluoresceinisothiocyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 og APC anti-CD16 antistoffer til sortering af CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, B-celler og NK-celler ved hjælp af et flowcytometer. Desuden blev transkriptomsekventering af fem subpopulationer udført for at udforske deres funktioner og patogene mekanismer i IM.
Introduction
Epstein-Barr-virus (EBV), et γ-herpesvirus, også kendt som human herpesvirus type 4, er allestedsnærværende i den menneskelige befolkning og etablerer livslang latent infektion hos mere end 90% af den voksne befolkning1. De fleste EBV-primære infektioner forekommer i barndommen og ungdommen, hvor en brøkdel af patienterne manifesterer sig med infektiøs mononukleose (IM)2, der viser karakteristisk immunopatologi, herunder et aktiveret immunrespons med CD8 + T-celler i blod og en forbigående proliferation af EBV-inficerede B-celler i oropharynx3. Forløbet af IM kan vare i 2-6 uger, og størstedelen af patienterne kommer sig godt4. Imidlertid udvikler nogle individer vedvarende eller tilbagevendende IM-lignende symptomer med høj sygelighed og dødelighed, som er klassificeret som kronisk aktiv EBV-infektion (CAEBV)5. Derudover er EBV en vigtig onkogen virus, som er tæt forbundet med en række maligniteter, herunder epithelioid og lymfoid maligniteter såsom asnasopharyngeal carcinom, Burkitts lymfom, Hodgkins lymfom (HL) og T / NK-cellelymfom6. Selvom EBV er blevet undersøgt i over 50 år, er dets patogenese og den mekanisme, hvormed det inducerer spredning af lymfocytter, ikke blevet fuldt belyst.
Flere undersøgelser har undersøgt de molekylære signaturer for immunpatologien af EBV-infektion ved transkriptomsekventering. Zhong et al. analyserede heltranskriptomprofilering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) fra kinesiske børn med IM eller CAEBV for at finde ud af, at CD8 + T-celleudvidelse overvejende blev fundet i IM-gruppe7, hvilket tyder på, at CD8 + T-celler kan spille en vigtig rolle i IM. Tilsvarende fandt en anden undersøgelse lavere andele af EBV-specifikke cytotoksiske T- og CD19+ B-celler og højere procentdele af CD8+ T-celler hos patienter med IM forårsaget af primær EBV-infektion end hos patienter med IM forårsaget både af EBV-reaktivering og andre midler8. B-celler er først involveret i IM, fordi EBV-receptorer præsenteres på deres overflade. Al Tabaa et al. fandt, at B-celler var polyklonalt aktiverede og differentierede intoplasmablaster (CD19+, CD27+ og CD20− og CD138− celler) og plasmaceller (CD19+, CD27+ og CD20− og CD138+) under IM9. Desuden fandt Zhong et al., at monocytmarkører CD14 og CD64 blev opreguleret i CAEBV, hvilket tyder på, at monocytter kan spille en vigtig rolle i CAEBV’s cellulære immunrespons gennem antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) og hyperaktiv fagocytose7. Alka et al. karakteriserede transkriptomet af MACS sorterede CD56dim CD16+ NK-celler fra fire patienter med IM eller HL og fandt ud af, at NK-celler fra både IM og HL havde nedreguleret medfødt immunitet og kemokinsignaleringsgener, som kunne være ansvarlige for hyporesponsen af NK-celler10. Derudover analyserede Greenough et al. genekspression af sorterede CD8 + T-celler fra 10 PBMC’er af personer med IM. De rapporterede, at en stor del af CD8 + T-celler i IM var virusspecifikke, aktiverede, delte og primerede til at udøve effektoraktiviteter11. Både T-cellemedierede, EBV-specifikke reaktioner og NK-cellemedierede, uspecifikke reaktioner spiller væsentlige roller under primær EBV-infektion. Disse undersøgelser undersøgte imidlertid kun transkriptomresultaterne af den forskelligartede blanding af immunceller eller kun en bestemt subpopulation af lymfocytter, hvilket ikke er tilstrækkeligt til en omfattende sammenligning af de molekylære egenskaber og funktioner hos forskellige immuncelleunderpopulationer hos børn med IM i samme sygdomstilstand.
Dette papir beskriver en metode, der kombinerer immunomagnetiske perler og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at isolere og analysere definerede immuncelleunderpopulationer af PBMC’er (monocytter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler). Ved hjælp af denne metode kan magnetiske og fluorescerende mærkede celler renses ved hjælp af en magnetisk separator og FACS eller analyseres ved flowcytometri. RNA kan ekstraheres fra de oprensede celler til transkriptomsekventering. Denne metode vil muliggøre karakterisering og genekspression af forskellige immunceller i samme sygdomstilstande hos personer med IM, hvilket vil udvide vores forståelse af immunpatologien af EBV-infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol repræsenterer en effektiv måde at sortere perifere blodimmuncelleunderpopulationer på. I denne undersøgelse blev venøse blodprøver fra patienter med IM, raske EBV-bærere og EBV-uinficerede børn valgt som forskningsmål. Dette arbejde ved hjælp af perifert blod fra patienter i IM fokuserer primært på at analysere og bestemme proportionerne af forskellige celleundergrupper gennem flerfarvet flowcytometri. Transkriptomsekventering anvendes hovedsageligt til påvisning og analyse af en bestemt subpo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) og CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
Materials
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
