Summary
Periferik kan mononükleer hücrelerinin (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve doğal öldürücü hücreler) tanımlanmış bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasını birleştiren bir yöntem tanımladık. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler saflaştırılabilir ve analiz edilebilir.
Abstract
Enfeksiyöz mononükleoz (IM), çoğunlukla primer Epstein-Barr virüsü (EBV) enfeksiyonu ile ilişkili akut bir sendromdur. Başlıca klinik semptomlar düzensiz ateş, lenfadenopati ve periferik kanda önemli ölçüde artmış lenfositlerdir. IM'nin patojenik mekanizması hala belirsizdir; bunun için etkili bir tedavi yöntemi yoktur, esas olarak semptomatik tedaviler mevcuttur. EBV immünobiyolojisindeki ana soru, enfekte bireylerin sadece küçük bir alt kümesinin neden ciddi klinik semptomlar gösterdiği ve hatta EBV ile ilişkili maligniteler geliştirdiği, çoğu bireyin virüsle yaşam boyu asemptomatik olduğudur.
B hücreleri ilk önce IM'ye dahil olurlar, çünkü EBV reseptörleri yüzeylerinde sunulur. Doğal öldürücü (NK) hücreler, EBV ile enfekte olmuş hücreleri öldürmek için önemli olan sitotoksik doğuştan gelen lenfositlerdir. CD4 + T hücrelerinin oranı azalırken, CD8 + T hücrelerinin oranı akut EBV enfeksiyonu sırasında dramatik olarak genişler ve CD8 + T hücrelerinin kalıcılığı IM'nin yaşam boyu kontrolü için önemlidir. Bu bağışıklık hücreleri IM'de önemli roller oynar ve işlevlerinin ayrı ayrı tanımlanması gerekir. Bu amaçla, monositler önce CD14 mikroboncukları, bir sütun ve manyetik bir ayırıcı kullanılarak IM bireylerinin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) ayrılır.
Kalan PBMC'ler, CD4 + T hücrelerini, CD8 + T hücrelerini, B hücrelerini ve NK hücrelerini bir akış sitometresi kullanarak sıralamak için peridinin-klorofil-protein (PerCP) / Siyanin 5.5 anti-CD3, allofikokosyanin (APC) / Siyanin 7 anti-CD4, fikoeritrin (PE) anti-CD8, floresan izotiyosiyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 ve APC anti-CD16 antikorları ile boyanır. Ayrıca, IM'deki fonksiyonlarını ve patojenik mekanizmalarını araştırmak için beş alt popülasyonun transkriptom dizilimi yapıldı.
Introduction
İnsan herpes virüsü tip 4 olarak da bilinen bir γ-herpes virüsü olan Epstein-Barr virüsü (EBV), insan popülasyonunda her yerde bulunur ve yetişkin nüfusun% 90'ından fazlasında yaşam boyu gizli enfeksiyon oluşturur1. EBV primer enfeksiyonunun çoğu çocukluk ve ergenlik döneminde ortaya çıkar, hastaların bir kısmı enfeksiyöz mononükleoz (IM)2 ile kendini gösterir, kandaki CD8 + T hücreleri ile aktive olmuş bir immün yanıt ve orofarenks3'te EBV ile enfekte B hücrelerinin geçici proliferasyonu dahil olmak üzere karakteristik immünopatoloji gösterir. IM'nin seyri 2-6 hafta sürebilir ve hastaların çoğunluğuiyileşir 4. Bununla birlikte, bazı bireylerde kronik aktif EBV enfeksiyonu (CAEBV)5 olarak sınıflandırılan yüksek morbidite ve mortalite ile kalıcı veya tekrarlayan IM benzeri semptomlar gelişir. Ek olarak, EBV, nazofaringeal karsinom, Burkitt lenfoma, Hodgkin lenfoma (HL) ve T / NK hücreli lenfoma6 gibi epiteloid ve lenfoid maligniteler de dahil olmak üzere çeşitli malignitelerle yakından ilişkili olan önemli bir onkojenik virüstür. EBV 50 yılı aşkın süredir çalışılmasına rağmen, patogenezi ve lenfositlerin proliferasyonunu indüklediği mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır.
Birçok çalışmada transkriptom dizilimi ile EBV enfeksiyonunun immünopatolojisi için moleküler imzalar araştırılmıştır. Zhong ve ark., CD8 + T hücre genişlemesinin ağırlıklı olarak IM grubu7'de bulunduğunu bulmak için IM veya CAEBV'li Çinli çocuklardan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) tüm transkriptom profillemesini analiz ettiler ve CD8 + T hücrelerinin IM'de önemli bir rol oynayabileceğini düşündürdüler. Benzer şekilde, başka bir çalışmada, birincil EBV enfeksiyonunun neden olduğu IM'li hastalarda, hem EBV reaktivasyonunun hem de diğer ajanların neden olduğu IM'li hastalara göre daha düşük oranda EBV'ye özgü sitotoksik T ve CD19 + B hücrelerinin daha düşük oranları veCD8 + T hücrelerinin daha yüksek yüzdeleri bulunmuştur. B hücreleri ilk önce IM'ye dahil olurlar, çünkü EBV reseptörleri yüzeylerinde sunulur. Al Tabaa ve ark., IM9 sırasında B hücrelerinin poliklonal olarak aktive olduğunu ve intoplazmablastlar (CD19+, CD27+ ve CD20− ve CD138− hücreleri) ve plazma hücrelerinin (CD19+, CD27+ ve CD20− ve CD138+) farklılaştığını bulmuşlardır. Ayrıca, Zhong ve ark. monosit belirteçleri CD14 ve CD64'ün CAEBV'de yukarı regüle olduğunu bulmuşlardır, bu da monositlerin antikora bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC) ve hiperaktif fagositoz7 yoluyla CAEBV'nin hücresel immün yanıtında önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Alka ve ark., dört IM veya HL hastasından CD56dim CD16 + NK hücrelerini sıralayan MACS'nin transkriptomunu karakterize ettiler ve hem IM hem de HL'den NK hücrelerinin, NK hücrelerinin hipoyanıtlılığından sorumlu olabilecek doğuştan gelen bağışıklık ve kemokin sinyal genlerini aşağı regüle ettiğini bulmuşlardır10. Ek olarak, Greenough ve ark., IM'li bireylerin 10 PBMC'sinden sıralanmış CD8 + T hücrelerinin gen ekspresyonunu analiz ettiler. IM'deki CD8 + T hücrelerinin büyük bir kısmının virüse özgü, aktive edilmiş, bölünen ve efektör aktivitelerini uygulamak için astarlanmış olduğunu bildirmişlerdir11. Hem T hücresi aracılı, EBV'ye özgü yanıtlar hem de NK hücre aracılı, spesifik olmayan yanıtlar primer EBV enfeksiyonu sırasında önemli roller oynamaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar sadece immün hücrelerin çeşitli karışımının veya sadece belirli bir lenfosit alt popülasyonunun transkriptom sonuçlarını araştırmıştır; bu, aynı hastalık durumundaki IM'li çocuklarda farklı immün hücre alt popülasyonlarının moleküler özelliklerinin ve fonksiyonlarının kapsamlı bir şekilde karşılaştırılması için yeterli değildir.
Bu yazıda, PBMC'lerin (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve NK hücreleri) tanımlanmış immün hücre alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamayı (FACS) birleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler manyetik bir ayırıcı ve FACS kullanılarak saflaştırılabilir veya akış sitometrisi ile analiz edilebilir. RNA, transkriptom dizilimi için saflaştırılmış hücrelerden ekstrakte edilebilir. Bu yöntem, IM'li bireylerin aynı hastalık durumlarında farklı bağışıklık hücrelerinin karakterizasyonunu ve gen ekspresyonunu sağlayacak ve bu da EBV enfeksiyonunun immünopatolojisi hakkındaki anlayışımızı genişletecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
IM'li hastalardan (n=3), sağlıklı EBV taşıyıcılarından (n=3) ve EBV ile enfekte olmayan çocuklardan (n=3) kan örnekleri alındı. Gönüllüler Pekin Çocuk Hastanesi, Capital Medical Üniversitesi'nden işe alındı ve tüm çalışmalar etik olarak onaylandı. Etik onay, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi Etik Kurulu tarafından alınmıştır (Onay Numarası: [2021]-E-056-Y). Hastaların bilgilendirilmiş onamından feragat edildi, çünkü çalışma sadece klinik testler için kalan örnekleri kullandı. Hasta gizliliğini korumak için tüm veriler tamamen kimliksizleştirildi ve anonimleştirildi.
1. PBMC'lerin periferik kandan izolasyonu
- IM'li hastalardan standart venipunktur ileK3EDTA tüplerine taze periferik kan (2 mL) toplayın.
NOT: Hücre canlılığını korumak için işlemin hızlı olması gerekir. - Periferik kanı fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kat hacme kadar seyreltin ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde insan lenfosit ayırma ortamının (yoğunluk: 1.077 ± 0.001 g / mL) üzerine yerleştirin.
NOT: Kan, PBS ve ayırma ortamının hacim oranı 1: 1: 1 idi. Kanı yavaşça ayırma ortamına ekleyin ve kanın ayırma ortamına yerleşmesini önlemek için hemen santrifüj yapın. - Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 800 × g'da santrifüj. Orta tabakayı (zenginleştirilmiş PBMC'ler) başka bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Santrifüjlemeden sonra, tüpün dibinde eritrositler, orta tabaka ayırma ortamı, üst tabaka plazma ve plazma tabakası ile ayırma sıvı tabakası arasında PBMC'ler (lenfositler ve monositler dahil) bulunur. - PBMC'leri 10 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 800 × g'da santrifüj yapın; süpernatantı dikkatlice atın.
- Yıkama ve santrifüjlemeyi tekrarlayın (adım 1.4) 2 x. PBMC'leri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL PBS ile yeniden askıya alın ve hücreleri tripan mavisi tabanlı, otomatik bir sayaçla sayın.
2. CD14 mikroboncukları kullanılarak CD14 + monositlerin PBMC'lerden izolasyonu
- PBS'de (pH 7.2) %0.5 fetal sığır serumu (FBS) ve 2 mM EDTA içeren bir tampon çözeltisi hazırlayın. Tamponu soğuk tutun (2-8 °C).
NOT: Hava kabarcıkları sütunu tıkayabileceğinden kullanmadan önce tamponun gazını çözün. Hücre yüzeyindeki antikorların kapanmasını ve spesifik olmayan hücre etiketlemesini önlemek için hücreleri soğuk tutun. - PBMC'leri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice atın. Hücreleri 80 μL tampon ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 20 μL CD14 mikroboncuk ekleyin.
NOT: ≤107 PBMC varsa, yukarıda belirtilen birimi kullanın. >107 PBMC varsa, tüm reaktif hacimlerini ve toplam hacmi orantılı olarak artırın. - CD14 mikroboncuklarını ve hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde iyice karıştırın ve 4 ° C'lik bir buzdolabında 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. PBMC'leri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 × g'da 1 mL tampon ve santrifüj ile yıkayın. Süpernatantı tamamen atın. Hücreleri 500 μL tampon ile yeniden askıya alın.
NOT: ≤108 PBMC varsa, yukarıda belirtilen birimi kullanın. >108 PBMC varsa, arabellek birimini orantılı olarak artırın. - Sütunlarla manyetik ayırma:
- Kolonu manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin ve sütunu 3 mL tamponla yıkayın. Hücre askıya alma özelliğini (adım 2.3'ten itibaren) sütuna ekleyin.
- Kolondan geçen etiketsiz hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve sütunu 3 mL tamponla yıkayın. Kolonu 3 x 3 mL tamponla yıkayın. Toplam atık suyu 15 mL santrifüj tüpünde toplayın.
- Kolonu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Sütuna 5 mL arabellek ekleyin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri derhal 15 mL santrifüj tüpüne boşaltmak için pistonu sıkıca sütuna itin.
- Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Sonraki transkriptom dizilemesinde kullanılmak üzere 500 μL PBS'deki hücreleri 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yeniden askıya alın.
3. Floresan etiketli antikor boyama ve FACS ile lenfosit popülasyonlarının PBMC'lerden ayrılması
- Etiketlenmemiş hücreleri (adım 2.4.2) 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. 100 μL PBS'deki hücreleri 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yeniden askıya alın.
- 100 μL hücre süspansiyonuna her etiketli antikorun (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) 2 μL'sini ekleyin (antikorların hacimleri ve konjuge florofor bilgileri Tablo 1'de gösterilmiştir), 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve ışıktan koruyun.
- 1 mL PBS ekleyerek ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yaparak hücreleri 2 x yıkayın. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde 500 μL PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Bir akış hücresi sıralayıcı sitometresinde veri elde etmeden önce hücre süspansiyonunu yavaşça vorteksleyin.
4. Akış sitometrisi parametre ayarı
- Gerektiğinde 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde hücre süspansiyonunun 100 μL'sini (bkz. bölüm 1) alın ve negatif kontrol numunesi, CD3 tek boyama örneği, CD4 tek boyama örneği, CD8 tek boyama örneği, CD19 tek boyama örneği ve CD56/CD16 boyama örneği ayarlayın.
- Hücre süspansiyonunun ve girdabının 100 μL'si başına karşılık gelen floresan etiketli antikorun 2 μL'sini ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. 300 × g'da 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı aspire edin. Peletleri 500 μL PBS ve vorteks ile yeniden askıya alın.
- Sıralama akışını devreye alın ve floresan boncukları kullanarak damlacıkları aşağıdaki gibi geciktirin:
- Hücre sıralama sistemini açın, açma programını çalıştırın, 85 μm nozulu takın ve sıralama akışını açın. Sıralama voltajını 4.500 V'a ve Freq'i 47 V'a ayarlayın.
- Ana akış damlacık kesme noktasını ve damlacık gecikmesini üreticinin talimatlarına göre ayarlayarak parametreleri ayarlayın12. İlk damlacık kesme noktası konumunu (Drop1) 275'e ve Breakoff penceresinde Gap'i 8'e ayarlayın. Sitometrinin akışı stabilize etmek için damlacık genlik değerini otomatik olarak belirlemesine izin vermek için Sweet Spot otomatik sıralama modunu açın.
- Floresan boncukları yükleyerek damlacık gecikmesini Yan Akış penceresinde 30,31'e ayarlayın ve boncukların başlangıç veya ince ayar modunda %>99'luk bir yan akış sapması elde etmesini sağlayın.
- Geçitlemeyi aşağıdaki gibi gerçekleştirmek için Şekil 1'de gösterilen geçit stratejisine bakın:
- İleri saçılma alanı (FSC-A)/yan saçılma alanı (SSC-A) nokta grafiği kullanarak, bozulmamış lenfosit popülasyonunu tanımlamak için çokgen kapısını (P1) çizin.
- FSC-A/FSC yüksekliği (FSC-H) nokta grafiği kullanarak, tek hücreleri tanımlamak ve çiftleri dışlamak için çokgen kapısını (P2) çizin (Şekil 1A).
- CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A nokta grafiği kullanarak, CD3+ T hücrelerini ve CD19+ B hücrelerini seçmek için dikdörtgen geçidi (P3) çizin (Şekil 1A,B).
- CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A nokta grafiği kullanarak, CD4 + T hücrelerini ve CD8 + T hücrelerini (sırasıyla bu belirteçler için yüksek floresanslı hücreler) seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin.
- CD56/CD16 APC-A/SSC-A nokta grafiği kullanarak, CD56+/CD16+ NK hücrelerini seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin (Şekil 1C).
- Negatif kontrol örneğini kullanarak enstrümantal parametreleri ayarlayın:
- Negatif kontrol tüpünü yükleme portuna takın ve Edinme Kontrol Paneli'nde Yükle'ye tıklayın. Yazılımda Sitometre Ayarları'nı seçin.
- Denetçi penceresinde, Parametreler sekmesini tıklatın ve FSC, SSC ve farklı floresan boyaların voltajlarını ayarlayın; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Siyanin 7: 824, FITC: 555, PerCP-Siyanin 5.5: 663.
- Tek lekeli numuneleri kullanarak kompanzasyonu ayarlayın13.
- Tek lekeli tüpleri sitometriye sırayla yükleyin ve yazılımda Sitometre Ayarları'nı seçin. Tazminatı ayarlamak için Ücret sekmesini tıklatın.
NOT: Akış sitometrisinin kompanzasyon referansı Tablo 2'de gösterilmiştir.
- Tek lekeli tüpleri sitometriye sırayla yükleyin ve yazılımda Sitometre Ayarları'nı seçin. Tazminatı ayarlamak için Ücret sekmesini tıklatın.
5. Akış sitometrisi ile hücre sıralama ve veri toplama
- Tüpü sitometreye yüklemeden önce hücreleri kısa bir süre için hücre süspansiyonunu (bölüm 1-3'e göre ayrılmış PBMC'ler) vorteksleyin. Kalan tüpleri buz üzerinde tutun.
- Sıralanmış hücrelerin tüp duvarına yapışmasını önlemek için dört toplama akış tüpüne 200 μL FBS ekleyin ve sitometre toplama odasına yerleştirin.
- CD3 + CD4 + T hücrelerini, CD3 + CD8 + T hücrelerini, CD3 − CD19 + B hücrelerini ve CD3 − CD56 + / CD16 + NK hücrelerini, dört akış tüpünde IM'li bir hastanın örneğinden ayrı olarak toplayın (Şekil 2A).
- Ayrılan hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Transkriptom dizilimi için hücrelere 200 μL RNA izolasyon reaktifi ekleyin.
- Örneklerin immün hücre alt popülasyonlarını sağlıklı EBV taşıyıcılarından ve EBV ile enfekte olmamış çocuklardan yukarıdaki adımlara göre ayırın (Şekil 2B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geçit stratejisinin referansı
Dört lenfosit alt popülasyonunu sıralamak için kullanılan geçit stratejisi Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısaca, lenfositler, granüloziteye (SSC-A) karşı boyutu (FSC-A) gösteren bir nokta grafiği üzerinde seçilir (P1). Ardından, boyutu (FSC-A) ve ileri dağılımı (FSC-H) gösteren bir nokta grafiğinde tek hücreler (P2) seçilirken, çift hücreler hariç tutulur. CD3+ T hücreleri (P3) ve CD19+ B hücreleri (Şekil 1B), CD3 PerCP-Cy5.5-A ile CD19 FITC-A'yı gösteren bir nokta grafiğinde ayrı ayrı seçilir. CD8+ T hücreleri ve CD4+ T hücreleri, P3'ten CD8 PE-A'ya karşı CD4 APC-Cy7-A'yı gösteren bir nokta grafiğinde ayrı ayrı seçilir. CD16+/CD56+ NK hücreleri, CD56/CD16 APC-A ile P4'ten SSC-A'yı gösteren bir nokta grafiği üzerinde seçilir (Şekil 1C).
IM'li hastaların örneklerinden tarif edilen yöntemle sıralanan dört hücre alt popülasyonunun temsili sonuçları Şekil 2A'da gösterilmiştir. Ayrıca, bu deneyin fizibilitesini doğrulamak için kontrol grupları olarak sağlıklı EBV taşıyıcılarından ve EBV ile enfekte olmamış çocuklardan alınan örnekler üzerinde hücre sıralama yaptık. Sağlıklı bir EBV taşıyıcısının örneğinden ayrılan hücre alt popülasyonlarının temsili sonuçları Şekil 2B'de gösterilmiştir. EBV ile enfekte olmamış çocukların örnekleminden sıralanan hücre alt popülasyonlarının temsili sonucu Şekil 2C'de gösterilmiştir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, P1 lenfositleri tanımlamak için kapılıydı ve çift hücreler P2 aracılığıyla dışlandı; P3, CD3 + T hücrelerini seçmek için kapılıydı ve P5, CD19 + B hücrelerini seçmek için kapılıydı; CD3+ CD8+ T hücreleri (P6) ve CD3+ CD4+ T hücreleri (P7) P3'ten ayrı olarak seçildi; CD16+/CD56+ NK hücreleri (P8) P4'ten seçildi. Bu alt popülasyonların her biri, aşağı akış deneyleri için ayrı ayrı sıralanabilir ve toplanabilir. Bu sistem, RNA ekstraksiyonu ve transkriptom dizilimi yoluyla gen ekspresyonunu analiz etmek için kullanıldı.
Tablo 3'te bildirildiği gibi, IM'li hastalarda hem sağlıklı EBV taşıyıcılarına hem de EBV ile enfekte olmamış çocuklara kıyasla CD3 + CD8 + T hücrelerinde bir artış gözlenmiştir (46.5 ± 4.0'a karşı 27.0 ± 0.1 ve 46.5 ± 4.0'a karşı 24.7 ± toplam lenfositler başına % CD3 + CD8 + T hücreleri); CD3+ CD4+ T hücrelerinin ve CD19+ B hücrelerinin oranlarının sağlıklı EBV taşıyıcıları ve EBV ile enfekte olmayan çocuklara kıyasla IM'li hastalarda azaldığı gözlenmiştir (13.4 ± 1.5'e karşı 19.3 ± 1.5 ve 13.4 ± 1.5'e karşı 23.6 ± toplam lenfositler başına % CD3+ CD4+ T hücreleri; 1.4 ± 0.3'e karşı 7.6 ± 0.7 ve 1.4 ± 0.3'e karşı 9.0 ± 1.5, toplam lenfositler başına % CD19+ B hücreleri). İm'li hastalarda CD16+/CD56+ NK hücrelerinin oranlarının EBV ile enfekte olmamış çocuklara kıyasla azaldığı gözlenmiştir (7.5 ± 0.5'e karşı 10.7 ± 0.4, total lenfositler başına % CD16+/CD56+ NK hücreleri). Bu sonuçlar, bu sıralama protokolünün etkinliğini doğrulamış ve IM ve EBV ile enfekte olmamış çocuklarda lenfosit alt gruplarının oranlarının farklı olduğunu göstermiştir.
Şekil 1: Bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını PBMC'lerden ayırmak için kullanılan genel geçit stratejisi. (A) CD3 + T hücrelerini ayırmak için PerCP-Cy5.5 filtresi kullanıldı. CD8 + T hücreleri ve CD4 + T hücreleri, CD8 PE-A'ya karşı P3'ten CD4 APC-Cy7-A'yı gösteren bir nokta grafiğinde ayrı ayrı seçildi. (B) CD19 + B hücrelerini tanımlamak için FITC filtresi kullanılmıştır. (C) APC filtresi, CD16+/CD56+ NK hücrelerini P4'ten ayırmak için kullanıldı. Kısaltmalar: PBMC'ler = periferik kan mononükleer hücreleri; FSC-A = ileri saçılma alanı; SSC-A = yan saçılma alanı; FSC-H = ileri saçılma yüksekliği; PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = fikoeritrin; APC = allofikosiyanin; FITC = floresein izotiyosiyanat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tanımlanan yöntemle başarılı bir şekilde izole edilen dört hücre alt popülasyonunun temsili sonuçları. (A) IM'li hastanın periferik kan örneğinden temsili hücre sıralama rakamları. (B) Sağlıklı EBV taşıyıcısının periferik kan örneğinden temsili hücre sıralama rakamları. (C) EBV ile enfekte olmamış çocukların periferik kan örneğinden temsili hücre sıralama rakamları. P1, lenfositleri tanımlamak için nokta çizim kapısı; P2, tek hücreleri seçmek için nokta çizim kapısı; P3, CD3 + T hücrelerini seçmek için nokta çizim kapısı; P4, CD3- CD19- lenfositleri tanımlamak için nokta çizim kapısı; P5, CD19 + B hücrelerini seçmek için nokta çizim kapısı; P6, P3'ten CD3 + CD8 + T hücrelerini seçmek için nokta çizim kapısı; P7, P3'ten CD3 + CD4 + T hücrelerini seçmek için nokta çizim kapısı; P8, P4'ten CD16+/CD56+ NK hücrelerini seçmek için nokta çizim kapısı. Kısaltmalar: EBV = Epstein-Barr virüsü; IM = enfeksiyöz mononükleoz; FSC-A = ileri saçılma alanı; SSC-A = yan saçılma alanı; FSC-H = ileri saçılma yüksekliği; PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = fikoeritrin; APC = allofikosiyanin; FITC = floresein izotiyosiyanat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Antikor Hedefi | Konjuge Florofor | Dozaj | Klon | Izotip |
| CD3 | Per CP/Siyanin5.5 | 2 μL | SK7 Serisi | Fare IgG1, κ |
| CD4 | APC/Siyanin7 | 2 μL | SK3 Serisi | Fare IgG1, κ |
| CD8 | PE | 2 μL | SK1 Serisi | Fare IgG1, κ |
| CD19 | FITC | 2 μL | HIB19 Serisi | Fare IgG1, κ |
| CD56 | APC | 2 μL | 5.1H11 | Fare IgG1, κ |
| CD16 | APC | 2 μL | 3G8 | Fare IgG1, κ |
Tablo 1: Akım sitometrisi için kullanılan antikorlar. Kısaltmalar: PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = fikoeritrin; APC = allofikosiyanin; FITC = floresein izotiyosiyanat.
| Akım sitometrisinin kompanzasyon referansı (%) | |||||
| PE | APC | APC-Cy7 Serisi | FITC | CP-Cy5.5 başına | |
| PE | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| APC | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 Serisi | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| FITC | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| CP-Cy5.5 başına | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Tablo 2: Akış sitometrisinin kompanzasyon referansı. Kısaltmalar: PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = fikoeritrin; APC = allofikosiyanin; FITC = floresein izotiyosiyanat.
| Farklı alt popülasyonlardaki lenfositlerin toplam sıralanmış lenfositler içindeki oranı (%) | |||
| lenfositler alt popülasyonu | IM | sağlıklı EBV taşıyıcıları | EBV-enfekte olmamış çocuklar |
| CD3+ T hücreleri | 80,5 ± 1,8 | 70,2 ± 2,3 | 66,1 ± 2,1 |
| CD3+ CD8+ T hücreleri | 46,5 ± 4,0 | 27,0 ± 0,1 | 24,7 ± 2,9 |
| CD3+ CD4+ T hücreleri | 13,4 ± 1,5 | 19.3 ± 1.5 | 23,6 ± 3,2 |
| CD16+/CD56+ NK hücreleri | 7.5 ± 0.5 | 2.2 ± 0.1 | 10.7 ± 0.4 |
| CD3- CD19+ B hücreleri | 1.4 ± 0.3 | 7.6 ± 0.7 | 9.0 ± 1.5 |
Tablo 3: Farklı gruplardan sıralanmış lenfositlerin oranı. Kısaltmalar: EBV = Epstein-Barr virüsü; IM = enfeksiyöz mononükleoz; NK = doğal katil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, periferik kan bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını sıralamanın etkili bir yolunu temsil eder. Bu çalışmada IM'li hastalardan, sağlıklı EBV taşıyıcılarından ve EBV ile enfekte olmamış çocuklardan alınan venöz kan örnekleri araştırma amacı olarak seçilmiştir. IM hastalarının periferik kanını kullanan bu çalışma, esas olarak çok renkli akış sitometrisi yoluyla farklı hücre alt kümelerinin oranlarını analiz etmeye ve belirlemeye odaklanmaktadır. Transkriptom dizilimi, esas olarak, aynı hastalık durumundaki IM'li çocuklarda farklı immün hücre alt popülasyonlarının moleküler özelliklerinin ve fonksiyonlarının kapsamlı ve spesifik karşılaştırmaları için yetersiz olan belirli bir lenfosit alt popülasyonunun tespiti ve analizi için kullanılır. Bu nedenle, periferik kandan çeşitli hücre tiplerinin ayrılması ve bu immün hücrelerin ekspresyon genleri ve fonksiyonlarındaki farklılıkları karşılaştırmak için transkriptom dizilimi yapılması, IM'nin patogenezinin incelenmesi için önemli veriler sağlayabilir.
FACS ayıklama, canlı, fraksiyone edilmiş hücreleri daha fazla in vitro veya in vivo deneyler için işleyebilmenin ek yararına sahiptir14. Hücre canlılığını korumak, sonraki deneyler için hayati öneme sahiptir. Bu protokolde hücre canlılığını artırmak için sıralama adımını optimize ettik - deneysel manipülasyonlar buz üzerinde veya 4 ° C'lik bir buzdolabında gerçekleştirildi. Uygun santrifüjleme hızı ve süresi de hücre izolasyonu için kritik öneme sahiptir. Sıralanmış hücrelerin verimi de bu yöntemdeki ana kısıtlamadır ve sıralama sırasında FBS kaplı tüplerin kullanılması, tüplere yapışan hücrelerin kaybını büyük ölçüde azaltabilir. FACS ayıklama cihazı için uygun ayarların sağlanması, toplama tüpünde hücre tıkanmasını veya çapraz kontaminasyonu önleyerek ayıklamanın genel verimliliğini artırabilir. Deneysel adımların ve ayarların optimizasyonu sayesinde, bu protokol manyetik veya floresan etiketlerin değiştirilmesiyle diğer bağışıklık hücrelerinin sıralanmasına ekstrapolasyon yapılabilir. Bununla birlikte, çocuk örneklerinin özgüllüğü (düşük kan toplama hacmi) nedeniyle, akış sıralama kanalının kısıtlanması nedeniyle alt popülasyonları sıralamaya devam etmeden sadece bağışıklık hücrelerinin ana popülasyonlarını (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve NK hücreleri) araştırdık. Bu çalışma, immünokompetan çocuklardan alınan periferik kan örneklerinin ve IM'den alınan örneklerin bu beş immün hücre grubunu başarıyla çözebildiğini göstermiştir; Bununla birlikte, hematolojik maligniteleri (örneğin, lösemi, lenfoma), lenfoproliferatif bozuklukları (örneğin, nakil sonrası lenfoproliferatif bozukluklar, CAEBV) veya primer immün yetmezlik/edinilmiş immün yetmezlik sendromu olan hastaların kan örnekleri bu protokole göre başarılı bir şekilde sıralanamayabilir.
IM kendi kendini sınırlayan bir hastalık olarak kabul edilir ve γδ T hücreleri, NKT hücreleri ve NK hücreleri gibi bağışıklık hücreleri antiviral bağışıklık yanıtında önemli bir rol oynar15. EBV-spesifik CD8 + T hücreleri büyük ölçüde bir efektör fenotip10,16'ya doğru farklılaşır ve geç efektör bellek ve efektör hücrelerin IM'den iyileşmeye17'ye kadar daralması vardır. Bu arada, IM'deki NK hücreleri, hücre aktivasyonueksikliği 10, aktive edici reseptör sinyalinin kaybı ve degranülasyon18 dahil olmak üzere fonksiyonel olarak kusurlu görünmektedir. Bazı çalışmalar, CD4 + T hücrelerinin sadece CD8 + T hücrelerine EBV ile enfekte B hücrelerini öldürmek ve ortadan kaldırmak için yardımcı olmakla kalmayıp, aynı zamanda sitokinler salgılayarak B hücrelerinin çoğalmasını inhibe ettiğini ve hatta EBV enfeksiyonu sırasında doğrudan öldürücü bir rol oynadığını bulmuştur19,20. Bu çalışmada gösterildiği gibi, IM'li hastalarda CD3 + CD8 + T hücrelerinin hem sağlıklı EBV taşıyıcılarına hem de EBV ile enfekte olmamış çocuklara kıyasla artmış bir oranı gözlenmiştir. Buna karşılık, IM'li hastalarda CD3 + CD4 + T hücrelerinin, CD19 + B hücrelerinin ve CD16 + / CD56 + NK hücrelerinin oranlarının EBV ile enfekte olmamış çocuklara kıyasla azaldığı gözlenmiştir. Bununla birlikte, IM'nin aynı hastalık durumundaki bu farklı bağışıklık hücrelerinin alt tiplerinin işlevi ve gen ekspresyonu belirsizliğini korumaktadır. IM'deki spesifik immün hücre alt kümelerinin gen ekspresyon profillerinin daha fazla analizi, IM'nin patojenik mekanizması hakkında fikir edinmeye yardımcı olabilir.
PBMC'lerde tanımlanmış immün hücre alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncuk sıralama ve FACS'ı birleştiren bir strateji sunuyoruz. Monositler önce CD14 mikroboncukları kullanılarak ayrılır ve kalan PBMC'ler, CD4 + T hücrelerini, CD8 + T hücrelerini, B hücrelerini ve NK hücrelerini FACS aracılığıyla sıralamak için karşılık gelen floresan etiketli antikorlarla boyanır. Bu sıralanmış hücreleri, IM'nin immünopatolojisindeki farklı bağışıklık hücrelerinin işlevini ve gen ekspresyonunu karakterize etmek için RNA ekstraksiyonu ve transkriptom dizilimi için kullandık. Sıralanmış hücrelerin saflığı ve verimi genellikle gen ekspresyon çalışmaları yapmak için yeterliydi (veriler gösterilmedi). Bu nedenle, ayrı immün hücre alt popülasyonlarının sıralama yöntemi, patojenik genleri, patojenik proteinleri ve potansiyel terapötik hedefleri tespit etmek için CAEBV, nakil sonrası lenfoproliferatif bozukluk gibi EBV ile ilişkili lenfoproliferatif bozuklukları daha fazla araştırmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82002130), Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7222059) ve Tıp Bilimleri için CAMS İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-026) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L.
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
