Платформа вакцины против наночастиц «Plug-And-Display» на основе везикул внешней мембраны, отображающих рецептор-связывающий домен SARS-CoV-2
Summary
Настоящий протокол описывает биоинженерию везикул наружной мембраны как платформу вакцины “Plug-and-Display”, включая производство, очистку, биоконъюгацию и характеристику.
Abstract
Биомиметические наночастицы, полученные из бактерий или вирусов, привлекли значительный интерес к исследованиям и разработкам вакцин. Наружные мембранные везикулы (OMV) в основном секретируются грамотрицательными бактериями во время среднего роста, с наноразмерным диаметром и самоадъювантной активностью, которая может быть идеальной для доставки вакцины. OMV функционируют как многогранная система доставки белков, нуклеиновых кислот и малых молекул. Чтобы в полной мере использовать биологические характеристики OMV, биоинженерные OMV, полученные из Escherichia coli, были использованы в качестве носителя, а SARS-CoV-2 рецептор-связывающий домен (RBD) в качестве антигена для создания платформы вакцины «Plug-and-Display». Домены SpyCatcher (SC) и SpyTag (ST) в Streptococcus pyogenes применялись для сопряжения OMV и RBD. Ген cytolysin A (ClyA) транслировался с геном SC в виде белка слияния после трансфекции плазмиды, оставляя реактивный сайт на поверхности OMV. После смешивания RBD-ST в обычной буферной системе в течение ночи между OMV и RBD образовалось ковалентное связывание. Таким образом, была получена мультивалентная вакцина OMV. Заменяя их различными антигенами, платформа вакцин OMV может эффективно отображать различные гетерогенные антигены, тем самым потенциально быстро предотвращая эпидемии инфекционных заболеваний. Этот протокол описывает точный метод построения платформы вакцины OMV, включая производство, очистку, биоконъюгацию и характеристику.
Introduction
В качестве потенциальной платформы вакцины везикулы наружной мембраны (OMV) привлекают все больше и больше внимания в последние годы 1,2. OMV, в основном секретируемые естественным образом грамотрицательными бактериями3, представляют собой сферические наноразмерные частицы, состоящие из липидного бислоя, обычно размером 20-300 нм4. OMV содержат различные родительские бактериальные компоненты, включая бактериальные антигены и патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), которые служат твердыми иммунными потенциаторами5. Используя свои уникальные компоненты, естественную структуру пузырьков и отличные участки модификации генной инженерии, OMV были разработаны для использования во многих биомедицинских областях, включая бактериальные вакцины6, адъюванты7, препараты иммунотерапии рака8, векторы доставки лекарств9 и антибактериальные адгезивы10.
Пандемия SARS-CoV-2, которая распространилась по всему миру с 2020 года, нанесла тяжелый урон глобальному обществу. Рецептор-связывающий домен (RBD) в спайковом белке (S-белок) может связываться с человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2), который затем опосредует проникновение вируса в клетку 11,12,13. Таким образом, RBD, по-видимому, является основной целью для открытия вакцин 14,15,16. Однако мономерный RBD плохо иммуногенен, а его малая молекулярная масса затрудняет распознавание иммунной системой, поэтому часто требуются адъюванты17.
С целью повышения иммуногенности RBD были построены OMV, отображающие поливалентные RBD. Существующие исследования с использованием OMV для отображения RBD обычно сплавляют RBD с OMV для экспрессии в бактериях18. Тем не менее, RBD является белком, полученным из вируса, и прокариотическая экспрессия, вероятно, влияет на его активность. Чтобы решить эту проблему, система SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), полученная из Streptococcus pyogenes, была использована для формирования ковалентного изопептида с OMV и RBD в обычной буферной системе19. Домен SC экспрессировали с помощью цитолизина А (ClyA) в виде белка слияния биоинженерной кишечной палочкой, а ST экспрессировали RBD через систему клеточной экспрессии HEK293F. OMV-SC и RBD-ST смешивали и инкубировали в течение ночи. После очистки ультрацентрифугированием или размерно-эксклюзионной хроматографией (SEC) получали OMV-RBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для создания платформы вакцины против наночастиц «Plug-and-Display» SC-сплавленный ClyA был экспрессирован в штаммах BL21(DE3), который является одной из наиболее широко используемых моделей для производства рекомбинантного белка из-за его преимуществ в экспрессии белка24, так что на по…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Ключевой программой Чунцинского фонда естественных наук (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) и проект Китайского национального фонда естественных наук (No 31670936, 82041045).
Materials
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
References
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
- Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
- Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
- Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems – Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
- Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
- Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
- Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
- Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
- Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
- Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
- Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
- Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
- Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
- Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
- Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
- Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
- Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
- Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
- Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
- Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
- van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
- Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
- Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
- Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
- Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
- Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
- Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).
