Summary
Этот протокол описывает оценку механической гиперчувствительности в крысиной модели невропатической орофациальной боли с использованием оперантного устройства для оценки орофациальной боли.
Abstract
Боль имеет сенсорный и аффективный компоненты. В отличие от традиционных, рефлекторных анализов боли, оперантные обезболивающие анализы могут давать более клинически значимые результаты, обращаясь к когнитивным и мотивационным аспектам боли у грызунов. В данной работе представлен протокол оценки механической гиперчувствительности после хронического сужения повреждения инфраорбитальных нервов (CCI-ION) у крыс с использованием орофациальной оперантной болевой системы. Перед операцией CCI-ION крыс обучали в устройстве для оценки орофациальной боли (OPAD) пить подслащенное сгущенное молоко, устанавливая лицевой контакт с металлическими шипованными стержнями и облизывающей трубкой.
В этом анализе крысы могут выбирать между получением молока в качестве положительного подкрепления или уходом от отвратительного механического стимула, который производится вертикальным рядом небольших пирамидообразных шипов с каждой стороны отверстия для доступа к награде. После 2 недель обучения в OPAD и до операции CCI-ION исходные данные о механической чувствительности записывались в течение 5 дней для каждой крысы в течение 10-минутного сеанса тестирования. Во время сеанса оперантная система автоматически записывает количество активаций бутылки вознаграждения (облизываний) и лицевых контактов, продолжительность контакта и задержку до первого облизывания, среди других показателей.
После базовых измерений крысы подверглись либо CCI-ION, либо фиктивной операции. В этом протоколе механическая гиперчувствительность была количественно определена путем измерения количества облизываний, задержки до первого облизывания, количества контактов и отношения облизываний к лицевым контактам (L / F). Данные показали, что CCI-ION привел к значительному снижению количества облизываний и соотношения L/F и увеличению латентности к первому облизыванию, что указывает на механическую гиперчувствительность. Эти данные подтверждают использование оперантных болевых анализов для оценки механической болевой чувствительности в доклинических исследованиях боли.
Introduction
Хроническая боль поражает миллионы американцев ежегодно1. К сожалению, хроническая боль трудно поддается лечению, так как существующие методы лечения относительно неэффективны для смягчения хронической боли и часто имеют нежелательные побочные эффекты при длительном применении 2,3,4. Традиционные доклинические анализы боли, такие как анализ фон Фрея, основаны на рефлексивных результатах или реакциях, стимулируемых болью5. Хотя анализ фон Фрея использовался в течение десятилетий для измерения механической аллодинии, он подвержен нескольким смешанным факторам, в частности смещению экспериментатора6. Использование тестирования фон Фрея для оценки орофациальной боли также проблематично из-за степени сдержанности, необходимой для обеспечения головы животного для успешного тестирования лицевой области, что может вызвать нежелательные стрессовые эффекты, такие как усиление боли или, наоборот, вызванная стрессом анальгезия.
Поведение, стимулируемое болью, также восприимчиво к ложноположительным исходам7 и не учитывает аффективный компонент боли, который является неотъемлемой частью человеческого болевого опыта8. Поэтому растет интерес к использованию оперантных моделей боли, которые оценивают депрессивное поведение, которое охватывает как сенсорные, так и аффективные компоненты боли, чтобы улучшить содержание и прогностическую валидность в доклиническом тестировании. Описанный здесь анализ оперантной орофациальной боли основан на парадигме вознаграждения-конфликта 9,10,11. В этом анализе грызун может выбирать между получением положительного подкрепления и подчинением себя ноцицептивному стимулу или отказом от вознаграждения и избеганием ноцицептивного стимула, тем самым контролируя количество боли, которую он испытывает. В отличие от традиционных анализов боли, анализ на основе оперантов независим от экспериментатора и не подвержен ложноположительным результатам из-за неблагоприятных седативных эффектов.
Вредные ощущения от головы и лица переносятся офтальмологической, верхнечелюстной и нижнечелюстной ветвями тройничного нерва. Травма или воспаление тройничного нерва повышает чувствительность сенсорных нейронов к тепловым или механическим раздражителям 12,13,14,15. Оперантные анализы орофациальной боли обеспечивают автоматическое измерение тепловой или механической орофациальной боли, передаваемой тройничным нервом у грызунов 11,12,16,17,18. Стимуляция нетоксичными и вредными раздражителями является важным различием между тестированием тепловой и механической аллодинии и гипералгезии в орофациальной области с помощью OPAD, поскольку они могут представлять собой проявления различных основных механизмов.
В орофациальном термическом анализе животные прижимают свою морду к гладким термодам, чтобы получить доступ к награде. Термоды могут быть настроены на различные холодные, теплые и горячие температуры, что позволяет оценивать поведение в нейтральных или ноцицептивных условиях. В орофациальном механическом анализе животные прижимают свою морду к шипованным стержням во время оперантного тестирования; поскольку эти шипы вызывают некоторый уровень дискомфорта, грызуны могут пить меньше, когда их лица касаются шипов по сравнению с гладкими поверхностями термодов. Таким образом, оперантный орофациальный механический анализ позволяет оценить эффект различной степени механической ноцицептивной стимуляции. Ранее мы продемонстрировали, что OPAD является полезным и надежным методом оценки острого теплового9, а также острого механического19, ноцицепции и гипералгезии.
В этой статье сообщается об использовании недавно разработанной версии OPAD для оценки механической ноцицепции и гиперчувствительности. Кроме того, в качестве валидации мы демонстрируем способность CCI-ION индуцировать хроническую невропатию, которая приводит к предсказуемому ответу в OPAD. Также подробно описано, как использовать OPAD и связанное с ним программное обеспечение для быстрого получения и анализа поведенческих данных грызунов.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Университета Флориды и соответствовали стандартам, изложенным в Руководстве Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Здесь оценка механической гиперчувствительности с помощью OPAD описана с использованием крысиной модели нейропатической орофациальной боли. Схема временной шкалы, использованной в исследовании, показана на рисунке 1. Все поведенческие оценки проводились женщинами-экспериментаторами.
1. Животные
- Домашние самки крыс Sprague-Dawley (n = 8/группа, 150-200 г) парами в помещении с контролируемой температурой (22 °C ± 1 °C) с циклом 12 ч:12 ч светло-темного цикла. Обеспечьте еду и воду ad libitum. Держите крыс в учреждении в течение 5 дней для акклиматизации перед экспериментами.
- Выполняйте оперантные анализы боли в тот же день недели и в то же время (с 9 до 11 часов утра).
- В конце экспериментов усыпляют крыс путем обезглавливания после изофлурановой анестезии.
2. Настройка OPAD
- Поместите лотки для капель молока, клетки из плексигласа и металлические напольные решетки на OPAD. Прикрепите проводку к клеткам. Наденьте держатель бутылки на металлический столб в задней части устройства.
- Приготовьте соотношение воды 2:1 к подслащенному сгущенному молоку в качестве наградного раствора, открыв банку подслащенного сгущенного молока и налив ее в стакан объемом 1 л. Добавьте ~600 мл водопроводной воды к 300 мл молока. Сначала перемешайте раствор ложкой, а затем используйте перемешивание и мешалку с конфоркой. Затем наполните бутылки с молоком и держите запасной молочный раствор при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наполните раствор бульонного молока полиэтиленовой пищевой пленкой. Разогревайте молочный раствор перед каждым использованием. Запасной молочный раствор в холодильнике может свернуться через неделю. Когда он коагулирует, он может перекрыть облизывающую трубку. Поэтому выбросьте его и приготовьте новый запасной раствор. - Поместите бутылки с молоком на держатель для бутылок и отрегулируйте их так, чтобы животное могло дотянуться до носика. Затяните левую ручку держателя, чтобы закрепить бутылку на месте.
- Включите клетки с помощью переключателя на передней панели.
3. Настройка протокола и создание файла эксперимента
ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала настройте протокол для запуска эксперимента. Протокол описывает, как программное обеспечение ANY-maze выполняет эксперимент.
- Откройте программное обеспечение. Введите пароль. Нажмите Войти в систему или нажмите Enter.
- Щелкните Создать пустой эксперимент | Меню протокола .
- Выберите режим , который будет использовать этот протокол, и назовите протокол. В разделе Устройство щелкните Безымянный протокол, щелкните раздел Выберите режим, который будет использовать этот протокол , а в разделе Режимы для конкретного оборудования выберите Режим механической клетки OPAD и нажмите кнопку ОК. Затем назовите протокол (например, OPAD механический).
- Добавьте клетки OPAD.
- В разделе Устройство щелкните Устройство | Добавьте элемент , расположенный в верхней части панели Протокол | Новый | сепаратора OPAD Добавьте все подключенные клетки OPAD.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед добавлением клеток убедитесь, что все клетки включены.
- В разделе Устройство щелкните Устройство | Добавьте элемент , расположенный в верхней части панели Протокол | Новый | сепаратора OPAD Добавьте все подключенные клетки OPAD.
- Добавьте этапы тестирования эксперимента.
- В разделе Тестирование щелкните Этапы | Первый этап и название Стадия (например, Базовый день 1). Введите 10 минут для продолжительности теста. Чтобы добавить дополнительные этапы, щелкните Добавить элемент в верхней части панели Протокол | Новый этап.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый этап относится к сеансу, когда выполняется анализ. Например, на 10 дней обучения необходимо 10 этапов. Продолжительность испытания может быть увеличена или уменьшена в зависимости от экспериментальной конструкции.
- В разделе Тестирование щелкните Этапы | Первый этап и название Стадия (например, Базовый день 1). Введите 10 минут для продолжительности теста. Чтобы добавить дополнительные этапы, щелкните Добавить элемент в верхней части панели Протокол | Новый этап.
- Назначают курсы лечения группами.
- В разделе Дополнительные сведения щелкните Группы лечения. Проверить Использование групп лечения | Пользователь вручную назначит животных своим группам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Указанное программное обеспечение (см. Таблицу материалов) также позволяет распределять животных случайным образом или в определенном порядке. Эксперименты можно проводить вслепую. Чтобы увидеть назначенные группы лечения, снимите флажок Запускать эксперименты вслепую.
- В разделе Дополнительные сведения щелкните Группы лечения. Проверить Использование групп лечения | Пользователь вручную назначит животных своим группам.
- Назначьте идентификацию животных (ID).
- Откройте меню Протокол ; в разделе Дополнительная информация щелкните Идентификатор животного и установите флажок Использовать мои удостоверения для ссылки на животных.
- Откройте меню Эксперимент .
- Введите название эксперимента.
- Назовите процедуры, щелкнув Просмотреть процедуры, и введите названия лечения (например, Лечение 1: CCI-ION, Лечение 2: обман).
- Добавьте животных и назначьте лечение и идентификаторы животных, щелкнув Просмотреть животных | Добавьте животных, введите количество животных, которые будут протестированы, и нажмите кнопку ОК. Дождитесь появления списка животных и добавьте идентификаторы животных и методы лечения для каждой крысы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Список состояний , отображаемый рядом с идентификатором животного, будет установлен в значение Normal в начале исследования. Животные могут быть позже удалены из расписания тестирования, изменив их статус на Выведенные из эксплуатации или Удаленные.
- Сохраните протокол, щелкнув меню Протокол | Сохраните протокол , расположенный в верхней части панели Протокол . Введите Имя файла и пароль программного обеспечения (ANY-maze) и нажмите кнопку Сохранить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраненные протоколы можно повторно использовать для новых экспериментов. - Сохраните файл эксперимента, щелкнув Файл | Сохраните, введите пароль программного обеспечения и нажмите кнопку Сохранить.
4. Тренинги и базовые тестовые сессии
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведите крыс в комнату по крайней мере за 15 минут до теста, если комната поведенческого тестирования находится в том же помещении для животных. Если они транспортируются в испытательную комнату за пределами животного объекта, дайте крысам 1 час, чтобы акклиматизироваться в комнате.
- Перед базовыми записями обучите крыс в OPAD в течение 2 недель (5 дней в неделю, 10 минут / день) прижимать их лица к металлическим шипованным стержням для получения молочного раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативное изображение шипованных стержней и крысы, выполняющей анализ, показано на рисунке 2. - Настройте оборудование OPAD.
- Включите клетки с помощью переключателя на передней панели. Ищите зеленый свет на клетке, что означает, что клетка готова к тестированию.
- Дважды щелкните сохраненный файл эксперимента, чтобы открыть. Введите пароль. Нажмите Войти в систему или нажмите Enter.
- Дождитесь появления меню Тесты . В левой части экрана запишите количество животных и соответствующую клетку (например, животное 1 будет протестировано в клетке 1), этап, который будет запущен в этот день, и статус тестирования («готово»). В правой части экрана наблюдайте за картой каждого животного, которая показывает количество облизываний и контактов.
- Понаблюдайте за экраном клеток, на котором отображается идентификатор животного, подлежащего тестированию. Поместите каждую крысу в соответствующую клетку и дважды нажмите кнопку на клетке. Обратите внимание, что зеленый свет превратится в оранжевый свет после начала тестирования, а предупреждающий звук будет слышен по окончании сеанса тестирования.
- В течение первых 2 дней обучения поместите бутылки с молоком полностью в клетку, чтобы крысы могли пить молоко, не контактируя со стимулом.
- На 3-8 день обучения, как только животные начнут пить, постепенно перемещайте бутылки назад, чтобы побудить крыс прижать свои лица к шипованным брускам.
- В дни 9-10 дрессировки, как только животные полностью прижимаются к шипованным брускам и количество облизываний становится постоянным (минимум 500 облизываний в течение 10-минутных сеансов тестирования), обратите внимание на расположение бутылки молока для каждого животного и используйте это расстояние для базовых записей.
- После 2 недель обучения соберите данные с отмеченного расстояния до бутылки молока в течение 5 дней в качестве исходного уровня (10 мин / день).
5. Индукция орофациальной нейропатической боли и оценка механической гиперчувствительности
ПРИМЕЧАНИЕ: После базовых измерений крысы подверглись операции CCI-ION, которая включала двустороннюю перевязку ИОН, как описано ранее20. Контрольные крысы перенесли фиктивную операцию. В процедуре не использовалась предоперационная или послеоперационная анальгезия, поскольку она может изменить временное течение невропатии. ВНИМАНИЕ: Отходы изофлурана должны быть очищены через канистры с древесным углем. Лезвия скальпеля и иглы должны быть утилизированы в биологически опасных отходах.
- Обезболить крысу в индукционной камере смесьюО2 (1 л/мин) и 4% изофлурана и поддерживать анестетиковое состояние специализированным носовым конусом в течение всего периода операции.
- Поместите обезболенную крысу на хирургический верстак и удерживайте ее. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C с помощью грелки. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы они не пересыхали. Проверьте глубину анестезии, зажав палец ноги, и начните процедуру, когда рефлекс снятия пальца ноги больше не наблюдается.
- Выполните хирургическую процедуру под стереомикроскопом. Откройте рот с помощью втягивателей и втяните губу с помощью небольшого зажима.
- Сделайте небольшой разрез между дорсальной десной и губой с помощью лезвия скальпеля (#15). Аккуратно отрежьте мягкие ткани, используя кончик лезвия скальпеля, чтобы выявить ветвь ИОНА.
- Поместите две хромированные кишечные (#5-0) лигатуры вокруг ИОНА, используя тупую, изогнутую шприцевую иглу.
- Закройте рану с помощью тканевого клея.
- Для фиктивной операции подвергните ИОН, используя ту же процедуру, но не связывайте нерв.
- После операции обеспечьте размягченный молоком чау грызунов в течение 2 дней, чтобы стимулировать прием пищи и предотвратить обезвоживание.
- Тестируйте крыс в OPAD на следующий день после операции в течение 3 последовательных дней, а затем 3 дня в неделю (например, каждый вторник, четверг и пятницу) в течение следующих недель, пока цифры лизуна не достигнут своих базовых значений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность механической чувствительности, индуцированной CCI-ION, может зависеть от пола, напряжения используемого грызуна и производительности экспериментатора. Таким образом, может быть неточно указывать определенную продолжительность для тестовых животных. Следовательно, тестирование до тех пор, пока числа лизуна не достигнут базовых значений, является более точным.
6. Очистка устройства
- После завершения тестирования закройте программное обеспечение, щелкнув значок x в правом верхнем углу, и дождитесь автоматического сохранения данных.
- Выключите клетки с помощью переключателя на передней панели.
- Отсоедините провода от металлических напольных решеток. Снимите и вымойте лотки для капель молока, клетки из оргстекла, металлические решетки для пола и держатели для бутылок с мылом для посуды. Положите все на сушилку.
- Протрите металлические шипованные стержни, испытательное устройство и лабораторные стенды с использованием 70% изопропилового спирта.
ПРИМЕЧАНИЕ: С инструментами нужно обращаться осторожно. Используйте мягкие щетки, чистя бутылки с молоком и облизывая трубки. Грязное оборудование может привести к накоплению бактерий.
7. Анализ данных
- Дважды щелкните файл эксперимента, чтобы открыть его.
- Нажмите на меню Результаты . Выберите, какие меры (например, лизнуть, связать) или тестовые дни увидеть.
- Щелкните Текст , График или Статистика в верхней части панели Результаты, чтобы просмотреть текст, график или отчет статистического анализа.
- Чтобы просмотреть необработанные данные, щелкните меню Данные . Нажмите кнопку Сохранить в верхней части панели «Данные», чтобы сохранить данные в виде электронной таблицы, или нажмите кнопку Отправить , чтобы получить их по электронной почте.
- Чтобы изменить или добавить дополнительные переменные для просмотра, щелкните Выбрать данные, выберите меры и нажмите кнопку Просмотреть электронную таблицу.
- Статистический анализ
- Автоматически выводите количество облизываний и контактов, а также задержку первого облизывания из программного обеспечения и экспортируйте данные из программного обеспечения в электронную таблицу.
- Рассчитайте соотношение L/F как показатель гиперчувствительности, разделив количество облизываний на число контактов 21,22,23.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании одна из крыс в фиктивной группе была исключена из исследования из-за низкого числа облизываний (<500 облизываний) до операции. - Проанализируйте статистическую значимость различий между L/F, количество облизываний и контактов, а также задержку до первого облизывания с помощью двусторонних повторных измерений ANOVA, за которыми следуют множественные сравнения Даннетта или множественные сравнительные тесты Шидака, где это уместно.
ПРИМЕЧАНИЕ: P < 0,05 было сочтено статистически значимым. Данные были представлены в виде среднего ± стандартной погрешности среднего значения (SEM).
Representative Results
Пример того, как одна крыса облизывает бутылку с наградой и контактирует с металлическими шипованными стержнями на исходном уровне и через 2 недели, 4 недели и 6 недель после операции, представлен на рисунке 3. Во время нетоксичных периодов крысы, как правило, имеют длительные сеансы питья (например, на исходном уровне и восстановлении после CCI-ION: неделя 6 на изображении), и, после CCI-ION, количество лизунов уменьшается, поскольку они не могут поддерживать лицевой контакт с шипованными батончиками в течение длительного времени (рисунок 3A), без значительных изменений в периодах употребления алкоголя в фиктивной группе (рисунок 3B).
Крысы с CCI-ION имели значительное снижение количества облизываний до 4 недель после операции и увеличение латентности до первого облизывания на операционной неделе (неделя 0) и 1 неделе после операции по сравнению с исходным уровнем. Существенных изменений в фиктивной группе не произошло (рисунок 4A,B). CCI-ION приводил к уменьшению числа контактов, но эта разница не была существенной (рисунок 4C). CCI-ION также вызвал значительное снижение L/F, и снижение для группы CCI-ION было больше, чем снижение для фиктивной группы (рисунок 4D).
Эти результаты показывают, что после CCI-ION крысы демонстрируют менее вознаграждаемое поведение, пьющее молоко, и им требуется некоторое время, чтобы сделать первый лизун, что указывает на ноцифензивное поведение. Однако CCI-ION не влияет на их желание добраться до молока. Кроме того, снижение L/F крыс с CCI-ION указывает на механическую гиперчувствительность, так как L/F выше в безболезненных состояниях.
Рисунок 1: Схематическое представление дизайна исследования. Сокращения: OPAD = устройство для оценки орофациальной боли; CCI-ION = хроническое сужение нервов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативное изображение шипованных брусков и крысы, выполняющей анализ. Шипованные прутки изготовлены из металла из нержавеющей стали. Длина всего бруса составляет 7 см. Высота шипов 0,3 см. Расстояние между шипами составляет 0,5 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные попытки контакта и облизывание данных одной крысы с CCI-ION- и фиктивной операцией во время стандартного 10-минутного сеанса тестирования на исходном уровне и через 2 недели, 4 недели и 6 недель после операции. Сокращения: CCI-ION = хроническое сужение поражения инфраорбитальных нервов; АС = после операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Развитие механической гиперчувствительности после CCI-ION у крыс Sprague-Dawley. (A) У крыс с CCI-ION (n = 8) наблюдалось значительное снижение числа облизываний до 4 недель после операции и (B) увеличение латентности до первого облизывания на операционной неделе (неделя 0) и 1 неделе после операции (**p < 0,01, *p < 0,05: после хирургических недель против исходного уровня. #p < 0,05: CCI-ION vs. sham). Достоверного снижения в фиктивной группе не наблюдалось (n = 7, p > 0,05). (C) CCI-ION или фиктивная хирургия не привели к какому-либо существенному изменению числа контактов. (D) Крысы с CCI-ION показали значительное снижение L / F на операционной неделе и через 3 недели после и продемонстрировали тенденцию к снижению через 2 недели после операции. По сравнению с крысами фиктивной группы, это снижение было значительно выше у крыс CCI-ION и началось через 1 неделю после операции и продолжалось до 3 недель после операции. Не было выявлено существенной разницы в фиктивной группе (**p < 0,01, *p < 0,05: после хирургических недель против исходного уровня. # p < 0,05: CCI-ION против фиктивного). На графиках красная линия представляет группу CCI-ION, а синяя линия представляет фиктивную группу. Данные представлены как средние ± SEM. Значительные различия были проанализированы с помощью двусторонних повторных измерений ANOVA, за которыми последовали множественные сравнительные тесты Шидака или Даннетта, в зависимости от обстоятельств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Боль, вызванная безобидной механической стимуляцией лица и интраоральной слизистой оболочки, является характерной чертой орофациальных болевых состояний, включая невралгию тройничного нерва и расстройства височно-нижнечелюстного сустава24,25. Хотя тройничная нейропатическая боль клинически хорошо описана, оценка нейропатического ноцицептивного поведения у грызунов является сложной задачей. Анализы боли, измеряющие рефлексивное поведение, являются наиболее часто используемыми методами в доклинических исследованиях боли. Однако напряжение, связанное с тестированием аппарата, неспособность оценить аффективное состояние и предвзятость экспериментатора вызывают опасения относительно полезности и достоверности рефлекторных анализов26.
Это исследование вводит оценку механической чувствительности в орофациальной области крыс, демонстрируя ее чувствительность к CCI-ION с использованием оперантного анализа боли. Эта же оперантная система также может быть использована для проверки механической чувствительности мышей. Следует отметить, что штаммы мышей и крыс могут проявлять вариации в своем ответе на CCI-ION, и, таким образом, уровни механической гиперчувствительности могут отличаться. Основываясь на нашем опыте, крысы Sprague-Dawley обычно развивают стабильную механическую гиперчувствительность через 2 недели после CCI-ION, они начинают восстанавливаться через 4 недели после CCI-ION, и после 6 недель CCI-ION мы видим восстановление после операции.
В этом протоколе механическая гиперчувствительность была количественно определена путем измерения количества облизываний и контактов, L / F и задержки до первого облизывания. Данные показали, что CCI-ION привел к снижению L / F и количества реакций облизывания и увеличению латентности до первого ответа лизуна, что указывает на то, что животные не желали прижимать свои лица к шипованным полосам из-за повышенной орофациальной болевой чувствительности.
OPAD - это анализ конфликта вознаграждений, в котором животные должны терпеть ноцицептивные стимулы, чтобы получить доступ к приемлемой награде. На поведение облизывания в анализе может повлиять аппетитное поведение. Кроме того, в этом исследовании мы использовали крыс, у которых была шерсть на лице. Основываясь на предыдущем опыте анализа оперантной боли, среди грызунов голые штаммы лучше для обнаружения лицевых контактов16; однако на момент публикации голые штаммы крыс больше не были коммерчески доступны. Это можно считать ограничением исследования. Поскольку мы также использовали только самок крыс Sprague-Dawley, следует ожидать различий в болевых реакциях, связанных с полом и напряжением.
Есть также некоторые критические шаги для обеспечения оптимальных результатов с помощью анализа. Точные данные облизывания и контакта должны отображаться в виде сплошных красных и белых блоков в указанном программном обеспечении соответственно (см. Рисунок 3). Расстояние между шипами и бутылкой молока имеет решающее значение для успеха эксперимента. Если кончик бутылки с молоком находится слишком далеко вперед, животное не будет контактировать с шипами, а программное обеспечение не будет правильно регистрировать контакты или лизать цифры. И наоборот, если бутылка с молоком находится слишком далеко назад, контакты будут регистрироваться, но животное не сможет добраться до молока. Во время тренировок данные облизывания могут выглядеть как сплошные белые блоки, так как кончик бутылки с молоком находится слишком далеко вперед. Он превращается в красные твердые блоки, как только бутылка с молоком отодвигается назад. По какой-то причине, если данные облизывания начинают появляться в виде белых блоков с расстояния, которое было отмечено, может помочь небольшое нажатие на бутылку и перемещение держателя молока немного вниз / вверх.
Несколько моментов также могут рассматриваться как ограничения орофациальной оперантной болевой системы, описанной здесь. Дрессировка грызунов необходима и занимает недели. Перед каждым сеансом тестирования ограничение пищи необходимо у мышей, но не у крыс. Было показано, что незамерзшие мыши имеют низкие и непоследовательные показатели облизывания по сравнению с голодающимимышами 27. Поскольку система OPAD является моделью вознаграждения-конфликта, на нее может влиять аппетитное поведение животных или препарат, который влияет на аппетит. Наличие нескольких аппаратов также выгодно для сокращения общего времени тестирования животных, что может увеличить затраты. Тем не менее, орофациальные оперантные обезболивающие анализы по-прежнему выгодны по сравнению с обычными рефлекторными анализами, поскольку они позволяют одновременно тестировать нескольких животных и ограничивают взаимодействие между животными и экспериментаторами.
Оперантное обусловливание во время болевых состояний изменяет поведение человека и животного в соответствии с их последствиями28. Таким образом, использование модели «вознаграждение-конфликт» выгодно для оценки болевых состояний, поскольку позволяет животным выполнять оперантные реакции. Это более клинически значимо, потому что характеристики оперантного поведения включают намерение, мотивацию и, как правило, кортикальную обработку29. Поскольку животные добровольно приближаются к бутылке с наградой и могут свободно выходить из шипованных стержней в любое время, это интегрирует высшие центры мозга и позволяет оценить аффективно-мотивационные состояния, связанные с болью10. Таким образом, анализы оперантной боли обеспечивают превосходные данные при оценке боли и анальгетиков in vivo. Они также помогают понять ноцицептивные процессы в системе тройничного нерва, тем самым способствуя продвижению орофациального поля боли.
Disclosures
Джон К. Нойберт и Роберт М. Кодл являются изобретателями OPAD. Stoelting Co. является производителем OPAD, а Ричард Миллс является сотрудником Stoelting. Ричард Миллс, Джон К. Нойберт и Роберт М. Кодл являются предыдущими владельцами Velocity Laboratories, компании, которая предоставляет платное поведенческое тестирование с использованием оперантных болевых анализов.
Acknowledgments
Это исследование финансируется Фондом исследований лицевой боли.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
- Dahlhamer, J., et al. Prevalence of chronic pain and high-impact chronic pain among adults - United States, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (36), 1001-1006 (2018).
- Ab del Shaheed, C., Maher, C. G., Williams, K. A., Day, R., McLachlan, A. J. Efficacy, tolerability, and dose-dependent effects of opioid analgesics for low back pain: A systematic review and meta-analysis. JAMA Internal Medicine. 176 (7), 958-968 (2016).
- Chou, R., et al. The effectiveness and risks of long-term opioid therapy for chronic pain: A systematic review for a National Institutes of Health Pathways to Prevention Workshop. Annals of Internal Medicine. 162 (4), 276-286 (2015).
- Vowles, K. E., et al. Rates of opioid misuse, abuse, and addiction in chronic pain: A systematic review and data synthesis. Pain. 156 (4), 569-576 (2015).
- Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 211, 39-50 (2012).
- Bove, G. Mechanical sensory threshold testing using nylon monofilaments: The pain field's "tin standard". Pain. 124 (1-2), 13-17 (2006).
- Negus, S. S. Core outcome measures in preclinical assessment of candidate analgesics. Pharmacological Reviews. 71 (2), 225-266 (2019).
- Vierck, C. J., Hansson, P. T., Yezierski, R. P. Clinical and pre-clinical pain assessment: Are we measuring the same thing. Pain. 135 (1-2), 7-10 (2008).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to measure changes in nociceptive behavior. Journal of Visualized Experiments. (76), e50336 (2013).
- Murphy, N. P., Mills, R. H., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Operant assays for assessing pain in preclinical rodent models: Highlights from an orofacial assay. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 20, 121-145 (2014).
- Neubert, J. K., et al. Use of a novel thermal operant behavioral assay for characterization of orofacial pain sensitivity. Pain. 116 (3), 386-395 (2005).
- Neubert, J. K., Rossi, H. L., Malphurs, W., Vierck, C. J., Caudle, R. M. Differentiation between capsaicin-induced allodynia and hyperalgesia using a thermal operant assay. Behavioural Brain Research. 170 (2), 308-315 (2006).
- Kumada, A., et al. Intradermal injection of Botulinum toxin type A alleviates infraorbital nerve constriction-induced thermal hyperalgesia in an operant assay. Journal of Oral Rehabilitation. 39 (1), 63-72 (2012).
- Ma, F., Zhang, L., Lyons, D., Westlund, K. N. Orofacial neuropathic pain mouse model induced by Trigeminal Inflammatory Compression (TIC) of the infraorbital nerve. Molecular Brain. 5, 44 (2012).
- Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. Journal of Visualized Experiments. (103), e53167 (2015).
- Rohrs, E. L., et al. A novel operant-based behavioral assay of mechanical allodynia in the orofacial region of rats. Journal of Neuroscience Methods. 248, 1-6 (2015).
- Cha, M., Kohan, K. J., Zuo, X., Ling, J. X., Gu, J. G. Assessment of chronic trigeminal neuropathic pain by the orofacial operant test in rats. Behavioural Brain Research. 234 (1), 82-90 (2012).
- Zuo, X., Ling, J. X., Xu, G. Y., Gu, J. G. Operant behavioral responses to orofacial cold stimuli in rats with chronic constrictive trigeminal nerve injury: Effects of menthol and capsazepine. Molecular Pain. 9, 28 (2013).
- Nolan, T. A., Hester, J., Bokrand-Donatelli, Y., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Adaptation of a novel operant orofacial testing system to characterize both mechanical and thermal pain. Behavioural Brain Research. 217 (2), 477-480 (2011).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Ramirez, H. E., et al. Assessment of an orofacial operant pain assay as a preclinical tool for evaluating analgesic efficacy in rodents. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 426-432 (2015).
- Rossi, H. L., Vierck, C. J., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Characterization of cold sensitivity and thermal preference using an operant orofacial assay. Molecular Pain. 2, 37 (2006).
- Sapio, M. R., et al. Pain control through selective chemo-axotomy of centrally projecting TRPV1+ sensory neurons. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1657-1670 (2018).
- Lambru, G., Zakrzewska, J., Matharu, M. Trigeminal neuralgia: A practical guide. Practical Neurology. 21 (5), 392-402 (2021).
- Doshi, T. L., Nixdorf, D. R., Campbell, C. M., Raja, S. N. Biomarkers in temporomandibular disorder and trigeminal neuralgia: A conceptual framework for understanding chronic pain. Canadian Journal of Pain. 4 (1), 1-18 (2020).
- Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nature Reviews Neuroscience. 23 (2), 70-85 (2022).
- Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular Pain. 4, 43 (2008).
- Vlaeyen, J. W. S. Learning to predict and control harmful events: Chronic pain and conditioning. Pain. 156, Suppl 1 86-93 (2015).
- Vierck, C. J. Animal studies of pain: Lessons for drug development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. C., et al. , IASP Press. Chapter 23 475-495 (2006).
