Im lebenden Organismus Luminale Messung der durch Dehnung hervorgerufenen urothhelialen ATP-Freisetzung bei Nagetieren
Summary
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Messung von ATP-Konzentrationen im Lumen der Blase bei einem anästhesierten Nagetier.
Abstract
Es wird angenommen, dass ATP, das als Reaktion auf eine Blasendehnung aus dem Urothel freigesetzt wird, eine wichtige sensorische Rolle bei der Kontrolle der Miktion spielt. Daher ist die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung in einem physiologischen Umfeld ein wichtiger erster Schritt bei der Untersuchung der Mechanismen, die die purinerge Signalübertragung in der Harnblase steuern. Bestehende Techniken zur Untersuchung der mechanisch evozierten Urothel-ATP-Freisetzung verwenden kultivierte Zellen, die auf flexiblen Trägern oder Blasengewebe in Ussing-Kammern fixiert sind. Jede dieser Techniken ahmt jedoch die Bedingungen in der intakten Blase nicht vollständig nach. Daher wurde ein Versuchsaufbau entwickelt, um ATP-Konzentrationen im Lumen der Harnblase von Nagetieren direkt zu messen.
In diesem Aufbau werden die Blasen von anästhesierten Nagetieren durch Katheter sowohl in der Blasenkuppel als auch über die äußere Harnröhrenöffnung perfundiert. Der Druck in der Blase wird erhöht, indem der Harnröhrenkatheter verschlossen wird, während sterile Flüssigkeit durch die Kuppel in die Blase geleitet wird. Die Messung des intravesikalen Drucks erfolgt mit einem Druckwandler, der am Blasendomkatheter befestigt ist, ähnlich dem für die Zystometrie verwendeten Aufbau. Sobald der gewünschte Druck erreicht ist, wird die Kappe des Harnröhrenkatheters entfernt und Flüssigkeit für die ATP-Quantifizierung durch Luciferin-Luciferase-Assay gesammelt. Durch diesen Versuchsaufbau können die Mechanismen, die sowohl die mechanische als auch die chemische Stimulation der Urothel-ATP-Freisetzung steuern, untersucht werden, indem verschiedene Agonisten oder Antagonisten in das Perfusat aufgenommen oder die Ergebnisse zwischen Wildtyp- und genetisch veränderten Tieren verglichen werden.
Introduction
Es wird angenommen, dass ATP im Urin eine wichtige sensorische Rolle bei der Kontrolle der Miktion spielt1. Zum Beispiel wird angenommen, dass ATP aus dem Urothel als Reaktion auf Dehnung freigesetzt wird, wo es auf Rezeptoren auf blasenafferente Nerven wirken kann, um ihre Erregbarkeit zu erhöhen, was zu Sättigungsgefühlen führt2. Daher wird auch angenommen, dass ATP im Urin ein wichtiger Akteur bei der Entwicklung von Blasenpathologien sein könnte. Zur Unterstützung dieser Hypothese sind die ATP-Konzentrationen im Urin bei Patienten mit überaktiver Blase (OAB)3, Blasenschmerzsyndrom/interstitieller Zystitis (BPS/IC)4 oder einer Harnwegsinfektion (UTI)5,6 signifikant erhöht, alles Zustände, die durch erhöhte Dringlichkeit, Häufigkeit und manchmal Schmerzen gekennzeichnet sind. Umgekehrt wurde bei Patienten, die an einer Unterfunktion der Blase (UAB) leiden, die durch die Unfähigkeit gekennzeichnet ist, die Blase zu entleeren, und die manchmal eine verminderte Fähigkeit zur Wahrnehmung der Blasenfülle aufweisen kann, eineverminderte ATP-Konzentration im Urin nachgewiesen 7. Experimentell kann die Manipulation der ATP-Konzentrationen im Urin die Blasenreflexe bei der Ratte verändern. Die Erhöhung der ATP-Konzentrationen durch die Blockierung endogener ATPasen im Blasenlumen kann die Blasenentleerungshäufigkeit erhöhen, während die Verringerung der ATP-Konzentrationen durch Einträufeln exogener ATPasen in die Blase die Blasenentleerungshäufigkeit verringert8. Somit ist die Bedeutung von ATP im Urin für die Blasenfunktion klar.
Angesichts der offensichtlichen Bedeutung von ATP im Urin für die Pathologie der Blase ist die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Mechanismen, die die Freisetzung kontrollieren. Viele Studien wurden mit verschiedenen experimentellen Modellen durchgeführt, um die Urothel-ATP-Freisetzung zu messen. An erster Stelle stehen dabei Zellkulturen, entweder Primärkulturen oder Zelllinien. Die Verwendung von kultivierten Urothelzellen wird jedoch durch die Tatsache erschwert, dass Urothelzellen ihre physiologisch polarisierte Morphologie nur annehmen, wenn sie auf speziellen durchlässigen Membranen gezüchtet werden (z. B. Transwell-Technologie [Well-Inserts])9. Daher ist es schwierig, eine gemessene ATP-Freisetzung mit der Physiologie in Verbindung zu bringen. Urothelzellen, die auf Well-Inserts gezüchtet werden, können polarisieren und eine Barriere bilden, die dem ähnelt, was in vivo beobachtet wird. Das Wachstum eines vollständig differenzierten Urothels kann jedoch Tage oder Wochen dauern. Während es möglich ist, gut eingesetzte Einsätze in einer Ussing-Kammer zu montieren und Druck auf die apikale Seite auszuüben, um eine Dehnung zu verursachen, ist es schwierig, genügend Druck auszuüben, um die Bedingungen in der Blase während der Pathologie nachzuahmen (d.h. Drücke von 30 cm H2O oder höher). Ganzes Blasengewebe kann auch in einer Ussing-Kammer für Dehnungsexperimente montiert werden, aber dies entfernt die Blase aus dem Organismus zusammen mit den trophischen Faktoren, die die Gesundheit der Urothelzellen und damit die Funktion der Urothelbarriere aufrechterhalten. Daher ist der physiologisch relevanteste Weg, um die Freisetzung von ATP aus dem Urothel als Reaktion auf Dehnung oder Druck zu untersuchen, in vivo. Die chirurgischen Techniken, die für den Aufbau des Experiments erforderlich sind, sind identisch mit denen, die üblicherweise in der Zystometrie bei Tieren verwendet werden, und sollten daher von jedem, der mit dieser Technik vertraut ist, leicht durchgeführt werden können.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Technik, die zur Untersuchung von luminalem ATP bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200-250 g verwendet wird, da die unten beschriebene transurethrale Katheterisierung bei Weibchen viel einfacher ist. Die transurethrale Katheterisierung kann jedoch auch bei männlichen Nagetierendurchgeführt werden 10. Da nun auch bei Mäusen beiderlei Geschlechts eine transurethrale Katheterisierung durchgeführt wurde11, können diese Experimente leicht an Mäuse oder Ratten beiderlei Geschlechts oder unterschiedlicher Größe angepasst werden, je nach den Bedürfnissen des Forschungsteams.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Großteil der Forschung zur Urothel-ATP-Freisetzung wird in kultivierten Zellen durchgeführt, wobei entweder immortalisierte Zelllinien oder Primärkulturen von Nagetier-Urothelzellen verwendet werden. Während diese Modelle den Vorteil haben, dass sie einen relativ hohen Durchsatz haben (d.h. eine Kultur / Passage kann viele Platten / Schalen von Zellen bilden), wird ihre physiologische Relevanz verringert durch: 1) die Unfähigkeit von Urothelzellen, polarisiert zu wachsen, es sei denn, sie werden auf speziellen T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Nationalen Instituts für Diabetes und Verdauungs- und Nierenerkrankungen (NIDDK) an JMB (DK117884) unterstützt.
Materials
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
References
- Burnstock, G. Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease. Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).
- Birder, L. A. Urothelial signaling. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).
- Silva-Ramos, M., et al. Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome. PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).
- Sun, Y., Chai, T. C. Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).
- Gill, K., et al. Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms. BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).
- Säve, S., Persson, K. Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract. Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).
- Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release. Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).
- Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).
- Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral instillation procedure in adult male mouse. Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).
- Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).
- Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly luciferase inhibition. Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).
- Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays. ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).
- Harvey, E. N. Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence. Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).
- Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection. Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).
