이 논문은 공동 얽힌 액틴 필라멘트와 미세 소관의 조정 가능한 3차원 복합 네트워크를 엔지니어링하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 복합 재료는 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되는 능동적 구조 조정 및 탄도 운동을 거치며 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정됩니다.
반유연한 액틴 필라멘트와 단단한 미세소관의 상호 작용 네트워크로 구성된 복합 세포 골격은 미오신 II 및 키네신과 같은 운동 단백질을 사용하여 이동, 세포질 분열, 접착 및 기계 감지와 같은 주요 프로세스를 구동하는 힘을 재구성하고 생성합니다. 액틴-미세소관 상호작용은 세포골격의 다양성과 적응성의 핵심이지만, 미오신 및 키네신 활성과의 상호작용에 대한 이해는 아직 초기 단계입니다. 이 작업은 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되고 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정되는 활성 구조 조정 및 탄도 운동을 겪는 공동 얽힌 액틴 필라멘트 및 미세 소관의 조정 가능한 3 차원 복합 네트워크를 엔지니어링하는 방법을 설명합니다. 다중 스펙트럼 컨포칼 이미징을 사용하여 복합 구조 조정 및 모션을 가장 효과적으로 시각화하기 위한 미세소관 및 액틴 필라멘트의 형광 라벨링 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다. 마지막으로, 비평형 구조, 역학 및 역학을 정량적으로 특성화하는 데 사용할 수있는 데이터 분석 방법의 결과가 제시됩니다. 이 조정 가능한 생체 모방 플랫폼을 재현하고 조사하면 결합 된 운동 활동, 복합 역학 및 필라멘트 역학이 유사 분열에서 분극, 기계 감각에 이르기까지 무수한 세포 과정으로 이어질 수있는 방법에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
세포 골격은 세포에 구조적 및 기계적 지원을 제공하는 상호 작용하는 생체 고분자의 동적 복합 네트워크입니다. 관련 분자 모터와 결합 단백질은 세포 골격을 재구성하고 적응시켜 세포가 성장하고, 모양을 바꾸고, 뻣뻣해지고, 움직이고, 심지어 자가 치유될 수 있도록 하여 이동 및 분열에서기계 감지에 이르는 무수한 세포 과정을 가능하게 합니다1,2. 세포 생물 물리학에서의 중요성 외에도 세포 골격은 상처 치유 및 약물 전달에서 여과 및 소프트 로봇공학 1,3,4,5,6,7,8,9에 이르기까지 잠재적 인 재료 응용 분야에서 활성 물질의 전형적인 예입니다.
세포 골격에 고유 한 구조적 및 기계적 다양성과 다 기능성을 부여하는 두 가지 주요 특성은 다음과 같습니다 : 1) 반 유연한 액틴 필라멘트 및 경질 미세 소관과 같은 여러 상호 작용 단백질 필라멘트와 관련 결합 및 가교 결합 단백질을 포함하는 복합 특성 3,5,10; 2) 필라 멘트 단백질 1,7,11,12,13을 밀고 당기는 미오신 및 키네신과 같은 에너지 소비 모터를 통해 지속적으로 재구성, 이동, 거칠게 만들고 작업을 수행하는 능력. 이러한 우아한 복잡성은 세포 골격이 세포 운동성, 세포질 분열 및 상처 치유 3,6,7,11과 같은 다양한 과정을 매개할 수 있게 하지만, 재구성된 시험관 내 시스템에서 세포골격의 생체 내 특성을 재현하는 연구자의 능력을 방해합니다.
현재의 프론티어 재구성 노력은 얽히고 가교된 액틴 필라멘트 및 미세소관 3,10,14,15,16,17, 힘 생성 액토미오신 네트워크2,8,18,19,20,21 및 키네신-미세소관에 의해 구동되는 활성 네마틱스의 복합체에 중점을 둡니다. 상호 작용 22,23,24,25,26. 정상 상태 액틴-미세소관 복합체는 단일 성분 시스템(27)에 비해 향상된 필라멘트 이동성 및 증가된 강성과 같은 창발적 기계적 특성(15,16,27)을 나타내는 것으로 나타났다. 시험관내 액토미오신 시스템에 대한 연구는 액틴, 미오신 및 가교결합제 28,29,30,31의 농도에 의존하는 광범위한 구조적 및 역학적 특성을 보고하였다. 예를 들어, 충분한 가교가 있는 경우 액토미오신 네트워크는 대규모 수축 및 조잡함 2,28,30,32,33,34,35,36을 겪는 반면, 가교결합이 없으면 네트워크는 빠르고 불안정한 흐름과 파열을 나타냅니다.19,29 . 키네신 모터 클러스터를 사용하여 미세소관 다발을 가교결합하고 당기는 재구성된 미세소관 기반 활성 네마틱스는 오래 지속되는 난류, 확장, 좌굴, 파쇄 및 치유를 나타내는 것으로 보고되었습니다. 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47.
보다 최근에, 미오신 II 미니-필라멘트에 의해 구동되는 액틴-미세소관 복합체는 가교결합제가 없는 액토미오신 네트워크가 17,26,48을 나타내는 무질서한 흐름 및 네트워크 파열에 비해 더 질서 있는 수축 및 네트워크 무결성을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 복합 견고성과 힘 생성의 조합은 액틴과 미세소관이 유사한 농도로 존재할 때 최적화됩니다. 제형 공간의 이 영역에서 주요 출현 특징은 향상된 기계적 강도(26), 액틴 및 미세소관(26)의 배위 운동(26), 꾸준한 지속 수축 및 메조스케일 재구성(17)을 포함한다.
여기에서는 각각 액틴 필라멘트와 미세소관에 작용하는 미오신 II 미니 필라멘트와 키네신 클러스터에 의해 평형 밖으로 밀려나는 미세소관과 액틴 필라멘트의 얽히고 가교된 복합체를 엔지니어링하고 조정하는 프로토콜이 설명됩니다(그림 1). 이 종류의 복합 재료의 역학, 구조 및 역학은 필라멘트, 모터 및 가교 결합기의 상대적 농도에 의해 조정되어 대류 및 난류 흐름, 등방성 수축, 가속, 감속, 탈혼합, 경화, 이완 및 파열. 이 연구의 초점은이 종류의 활성 세포 골격 복합체를 준비하고 조정하는 것입니다. 그러나 연구자가 설명된 활성 복합재를 벤치마킹하고 특성화하는 데 도움이 되도록 다중 스펙트럼 컨포칼 현미경을 사용하는 효과적인 이미징 방법도 자세히 설명합니다. 마지막으로 복합 재료의 역학, 구조 및 역학을 측정하는 데 사용할 수 있는 주요 계산 분석 방법의 결과를 제시합니다. 연구원들은 복합재 17,26,49의 복잡한 역학 및 구조적 다양성을 특성화하도록 최적화되었으므로 차동 동적 현미경(DDM), 공간 이미지 자기 상관(SIA) 및 입자 이미지 속도계(PIV)를 포함하는 이러한 방법을 채택하는 것이 좋습니다.
아래에 설명된 단계는 복합재를 준비하고 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징하는 데 중점을 둡니다. 획득 후 데이터 분석 및 광학 핀셋 측정을 설명하는 프로토콜은 이전 작업 17,26,48,50에서 찾을 수 있으며 요청시 제공됩니다. 모든 자료는 제공된 자료표에 나열되어 있습니다.
위에서 설명한 재구성 시스템의 주요 발전은 모듈성과 조정 가능성이므로 사용자는 특정 세포 공정을 에뮬레이트하거나 특정 기능 또는 기계적 특성을 가진 재료를 엔지니어링하는 등 원하는 결과에 맞게 단백질, 모터, 가교제 등의 농도를 수정하는 것이 좋습니다. 액틴과 튜불린의 농도 범위에 대한 제한은 액틴(~0.2μM)57,58,59 및 튜불린(~3 – 4μM)60을 중합하는 데 필요한 임계 농도에 의해 하한으로 설정되고, 액틴 필라멘트(~90μM)61,62 또는 미세소관(~35μM)63의 네마틱 정렬로의 전환에 의해 상한으로 설정됩니다. . 액틴 단량체와 튜불린 이량체는 중합 후 함께 혼합되지 않고 함께 필라멘트로 중합되어 서로를 상승적으로 지지하는 균일하게 상호 침투하는 퍼콜레이션 네트워크를 형성해야 합니다. 합성물이 보여주는 새로운 역학은 이러한 상호 작용에 의존합니다. 표시된 결과를 성공적으로 재현하려면 프로토콜에 설명된 대로 모든 단계를 따르는 것이 일반적으로 중요하지만 일부 단계는 더 엄격하고 다른 단계는 특정 요구 사항과 사용 가능한 리소스에 맞게 수정 및 조정할 여지가 있습니다.
예를 들어, 재현 가능한 결과를 보장하는 한 가지 중요한 단계는 재료 표에 제공된 지침에 따라 시약을 적절하게 준비하고 보관하는 것입니다. 세포골격 단백질(액틴, 튜불린, 미오신, 키네신)은 불안정하므로 분취하고, 액체 질소로 급속 냉동하고, 일회용 분취량으로 -80°C에서 보관해야 합니다. -80 ° C에서 제거한 분취량은 얼음 위에 보관해야합니다. 세포골격 단백질은 추가적인 동결-해동 주기 후에 기능을 안정적으로 유지하지 못합니다.
미세소관은 액틴보다 해중합 및 변성에 더 민감합니다. -80 ° C에서 제거 된 후에는 중합 전에 튜 불린을 얼음에 보관하고 12 시간 이내에 사용해야합니다. 일단 중합되면 미세소관은 실온에서 보관해야 합니다. 해중합을 방지하기 위해 탁솔로 미세소관을 안정화하는 것도 중요합니다. 액틴 필라멘트의 팔로이딘 안정화는 미오신 및 키네신 활성과 경쟁하는 ATP 소비 액틴 트레드밀링을 억제하는 데에도 마찬가지로 중요합니다.
미오신 모터의 초 원심 분리는 비활성 미오신 죽은 머리를 제거하기 때문에 또 다른 중요한 단계입니다. 효소적으로 불활성인 단량체를 제거하지 않으면 액틴 네트워크의 수동 가교결합과 활성의 손실이 발생합니다. 모터의 ATPase 활성을 연장하기 위해, 크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 포스포키나제64 와 같은 ATP 재생 시스템이 혼입될 수 있다.
마지막으로, 복합 활성을 유지하려면 샘플 챔버의 벽에 대한 필라멘트 및 모터의 흡착을 억제해야 하며, 이는 현미경 커버슬립 및 슬라이드의 패시베이션으로 달성할 수 있습니다. 모터 단백질은 특히 흡착되기 쉽기 때문에 복합체가 샘플 챔버의 표면으로 당겨져 시야를 벗어나 2D로 붕괴되고 더 이상 활동하지 않습니다. 커버슬립과 슬라이드를 실란화하는 것은 표면을 부동태화하고 흡착을 방지하는 효과적인 방법입니다(1단계 참조). 시험관내 세포골격 실험에서 효과적으로 사용되는 대안적인 패시베이션 방법은 표면을 세포막(18)과 유사한 지질 이중층으로 코팅하는 것이다. 이 방법은 단백질을 표면에 묶거나 다른 특정 단백질-표면 상호 작용을 도입하려는 경우 이중층이 기능화 될 수 있기 때문에 유리합니다. 광학 핀셋 실험의 경우, 마이크로스피어의 패시베이션도 중요하며, 카르보디이미드 가교결합제화학 48을 통해 카르복실화된 마이크로스피어를 BSA 또는 PEG로 코팅함으로써 달성될 수 있다.
제시된 프로토콜에는 연구자가 필요에 맞게 변경하는 것을 고려할 수있는 몇 가지 측면이 있습니다. 첫째, 연구자들은 비 천연 비오틴 -NA 가교 결합제를 액틴과 미세 소관을 각각 가교 결합하는 알파-액티닌 또는 MAP65와 같은 생물학적 가교제로 대체하도록 선택할 수 있습니다 28,65,66. 여기에 설명된 복합재에서 비네이티브 가교결합제를 사용하는 것은 천연 가교결합제에 비해 향상된 재현성, 안정성 및 조정 가능성에 의해 동기가 부여됩니다. 강한 비오틴-NA 결합으로 인해, 가교결합제는 광범위한 회전율로 일시적으로 결합하는 대부분의 천연 가교결합제보다는 영구적인 것으로 가정할 수 있다. 과도 가교의 역학은 가교제와 모터에서 역학에 대한 기여를 구문 분석하는 것을 복잡하게 만듭니다. 또한, 비오틴-NA 링커는 액틴과 미세소관 모두를 가교결합하고 액틴을 미세소관에 가교결합하는 데 다용도로 사용할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 가교 모티프들 사이의 명확한 비교가 이루어질 수 있고, 다른 모든 변수들(예를 들어, 가교결합자 크기, 결합 친화도, 화학량론 등)을 고정시킬 수 있다. 마지막으로, 비오틴-NA 링커를 혼입하는 데 필요한 시약은 널리 상업적으로 이용 가능하고 잘 특성화되어 있으며 많은 생물물리학 실험실에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나 여기에 설명된 체외 플랫폼의 주요 강점 중 하나는 모듈성이므로 연구원은 원하는 경우 비오틴-NA 링커를 기본 링커로 원활하게 대체할 수 있어야 합니다.
둘째, 현재 프로토콜에서 액틴 단량체와 튜불린 이량체는 샘플 챔버에 추가하기 전에 원심분리 튜브에서 함께 필라멘트로 중합됩니다. 얽힌 필라멘트 단백질의 용액을 샘플 챔버로 흐르게 하면 특히 미세소관의 흐름 정렬이 발생하여 복합체의 원하는 등방성과 균질성이 깨질 수 있습니다. 실제로, 정상 상태 액틴-미세소관 복합체에 대한 이전 연구의 주요 발전은 액틴과 미세소관15,16,27의 등방성 상호 침투 네트워크의 형성을 보장하기 위해 액틴과 미세소관을 제자리에서(샘플 챔버에서) 공동 중합하는 능력이었습니다. 그러나 이러한 접근 방식을 활성 복합 재료로 확장하려면 액틴 및 튜불린 중합 전에 샘플에 모터를 추가하고 실험 전에 전체 샘플을 37°C에서 함께 배양해야 합니다. 프로토콜에 대한 이러한 변화에 대한 테스트는 경쟁하는 ATPase 활성 및 모터의 연장된 37°C 배양으로 인해 액틴 중합이 감소하고 식별 가능한 모터 활성이 없음을 초래했습니다. 다행히도 그림 2, 그림 3 및 그림 6에서 볼 수 있듯이 현재 프로토콜을 따를 때 복합 재료의 흐름 정렬을 식별할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고 연구자들은 활성 복합 재료의 현장 형성을 허용하는 프로토콜을 설계하는 것이 좋습니다.
또 다른 고려 사항은 형광 표지 체계로, 네트워크의 모든 액틴 필라멘트와 미세 소관에 희박하게 라벨링하는 것을 수반합니다. 이 라벨링 접근 방식은 추적 필라멘트 또는 마이크로스피어를 통해 구조와 역학을 추론하는 대신 네트워크의 구조를 직접 시각화하도록 최적화되었습니다. 그러나 단점은 개별 필라멘트가 밝게 레이블링되고 분해 될 수 없다는 것입니다. 연구자들이 단일 필라멘트를 해결하고 네트워크 구조를 시각화하기 위해 취할 수있는 한 가지 접근법은 다른 형광단으로 표지 된 미리 형성된 필라멘트에 도핑하여 주변 네트워크와 개별 필라멘트를 동시에 이미징 할 수 있도록하는 것입니다. 그러나 두 개 이상의 형광단과 여기/방출 채널을 사용하는 경우 채널 간 블리드스루를 제거하기 어려운 경우가 많으므로 형광단, 필터 및 레이저 강도를 선택할 때 주의해야 합니다.
관련 한계는 복합 재료에서 미오신 또는 키네신 모터를 시각화 할 수 없다는 것입니다. 사용된 형광 표지된 액틴 단량체와 튜불린 이량체는 상업적으로 이용 가능한 반면, 복합재에서 미오신 또는 키네신을 시각화하려면 자체 라벨링이 필요합니다. 연구원들은 이전에18,67에서 수행한 것처럼 모터에 레이블을 지정하는 다음 단계를 수행하여 모터 활동과 결합을 복합 재료가 나타내는 역학 및 구조에 명확하게 연결할 수 있도록 하는 것이 좋습니다.
마지막으로, 현재 프로토콜에서 키네신 활성의 시작 및 지속 기간은 제어되지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 미오신 활성은 상기 기재된 바와 같이 블레비스타틴의 광불활성화를 사용하여 제어되기 때문에, 키네신의 유사한 광활성화를 구축하기 위해, 광-활성화된 ATP를 혼입시킬 수 있다.
여기에 설명된 설계의 복잡성을 구축하고 세포 조건을 더 잘 모방하고 동적 구조-기능 매개변수 공간을 넓히기 위해 향후 작업은 비멘틴68,69와 같은 중간 필라멘트와 다인 13,70과 같은 다른 모터를 통합하는 데 중점을 둘 것입니다. 겔솔린은 또한 액틴 길이14를 조절하기 위해 다양한 농도로 통합될 뿐만 아니라 미세소관 경직을 조절하기 위한 타우 단백질도 포함될 것입니다.
요약하면, 제시된 프로토콜은 단일 시스템에서 서로 다른 기질에 작용하는 두 개의 개별 활성력 생성 구성 요소를 포함하는 세포 골격에서 영감을 받은 활성 물질 시스템의 역학, 구조 및 역학을 설계, 생성 및 특성화하는 방법을 설명합니다. 이 조정 가능한 모듈식 플랫폼은 재구성 노력을 세포 세포 골격을 모방하는 데 한 걸음 더 가까이 다가가게 하고 다양한 구성 요소를 독립적으로 통합, 제거 및 조정하여 넓은 위상 공간에 걸쳐 특성을 프로그래밍할 수 있는 고유한 기능을 제공합니다. 더욱이, 이 다용도 시스템의 모든 구성 요소는 상업적으로 입수가능하며(재료 표 참조), 앞서50에서 설명한 바와 같이 Ross Lab에서 정제되고 요청 시 제공되는 키네신 이량체를 제외하고. 마지막으로 모든 분석 코드는 GitHub49 를 통해 무료로 사용할 수 있으며 무료 프로그래밍 언어 및 소프트웨어(Python 및 피지)를 기반으로 합니다. 이러한 시스템을 설계하기위한 프로토콜의 투명한 보급은 다양한 전문 지식, 배경, 기관 제휴 및 연구 목표를 가진 다양한 사용자 그룹이이 플랫폼에 더 쉽게 액세스 할 수 있기를 바랍니다.
The authors have nothing to disclose.
데이터 분석에 도움을 준 Maya Hendija와 Jonathan Michel 박사, 유용한 토론과 안내를 해주신 Janet Sheung 박사, Moumita Das 박사, Michael Rust 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 RMRA 및 JLR에 수여되는 William M. Keck Foundation Research Grant 및 NSF DMREF Award (DMR 2119663)와 RMR-A 및 RJM에 수여 된 National Institutes of Health R15 Grants (R15GM123420, 2R15GM123420-02)의 지원을 받았습니다.
(-)-Blebbistatin Abbreviation used in paper: blebbistatin |
Sigma Aldrich | B0560 | Stock Concentration: 200 μM in DMSO Storage: dessicated, in DMSO, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dissolve 1 mg of powder to 200 μM in DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: limited shelf-life, typically stops functioning reliably after 3-4 months. purchase and prepare new solution every 3 months. |
1:20 488-tubulin:tubulin mixture Abbreviation used in paper: 5-488-tubulin |
NA | NA | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and 488-tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
1:20 R-tubulin:tubulin mixture Abbreviation used in paper: 5-R-tubulin |
NA | NA | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and rhodamine tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
actin (biotin): skeletal muscle Abbreviation used in paper: biotin-actin |
Cytoskeleton | AB07 | Stock Concentration: 1 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: (1) immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM, (2) once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC for up to 1 week |
actin (rhodamine): rabbit skeletal muscle Abbreviation used in paper: R-actin |
Cytoskeleton | AR05 | Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week |
adenosine triphosphate Abbreviation used in paper: ATP |
Thermo Fisher Scientific | A1048 | Stock Concentration: 100 mM Storage: in solution (pH 7), -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconsitute in DI H20, bring pH to 7 with NaOH Storage, Handling, Troubleshooting Notes: routinely check pH and adjust as needed, hydrolyzes over time, replace every ~6-12 months |
AlexaFluor488 Phalloidin Abbreviation used in paper: 488-phalloidin |
Thermo Fisher Scientific | A12379 | Stock Concentration: 100 μM DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 20 μM in PEM (1 μL in 4 μL PEM) |
AlexaFluor488–labeled actin Abbreviation used in paper: 488-actin |
Thermo Fisher Scientific | A12373 | Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: this item has been discontinued |
Basic Plasma Cleaner Abbreviation used in paper: plasma cleaner |
Harrick Plasma | PDC-32G | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Abbreviation used in paper: transparent film |
Thermo Fisher Scientific | 13-374-5 | |
D-(+)-Glucose Abbreviation used in paper: |
Thermo Fisher Scientific | A1682836 | Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 4.5 mg/ml in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should 45 μg/mL |
D-Biotin Abbreviation used in paper: biotin |
Fisher Scientific | BP232-1 | Stock Concentration: 1.02 mM in PEM Storage: dessicated, 4ºC |
deionized nanopure water Abbreviation used in paper: DI |
|||
Dimethyldichlorosilane Abbreviation used in paper: silane |
Thermo Fisher Scientific | D/3820/PB05 | Stock Concentration: 2% dissolved in Toulene |
Dithiothreitol Abbreviation used in paper: DTT |
Thermo Fisher Scientific | R0861 | Stock Concentration: 1 M in DMSO Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dilute to 2 mM in PEM immediately before each experiment |
DMSO Anhydrous Abbreviation used in paper: DMSO |
Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
F-Buffer Abbreviation used in paper: F-buffer |
NA | NA | Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 10 mM Imidazole (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP |
G-Buffer Abbreviation used in paper: G-buffer |
NA | NA | Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl2. Store at -20°C. |
glass microscope slide Abbreviation used in paper: slide |
Thermo Fisher Scientific | 22-310397 | |
Glucose oxidase + catalase + β-mercaptoethanol Abbreviation used in paper: GOC |
Sigma Aldrich | G2133-250KU, C1345, 63689 | Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: For 100x: 4.3 mg/ml glucose oxidase, 0.7 mg/ml catalase, 0.5% v/v β-mercaptoethanol in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should be: 0.005% β-mercaptoethanol, 43 μg/mL glucose oxidase, 7 μg/mL catalase |
glu-GOC oxygen scavenging system Abbreviation used in paper: glu-GOC |
NA | NA | Stock Concentration: 100x Storage: prepare fresh each time Stock and Experiment Recipes: mix equal parts Glu and GOC and add at 1/100 final sample volume immediately before imaging Storage, Handling, Troubleshooting Notes: prepare from Glu and GOC immediately before imaging |
Guanosine triphosphate Abbreviation used in paper: GTP |
Thermo Fisher Scientific | R0461 | Stock Concentration: 100 mM Storage: 100 μL aliquots at -20ºC |
Instant Mix 1-minute epoxy Abbreviation used in paper: epoxy |
Loctite | 1366072 | |
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS Abbreviation used in paper: kinesin |
Prepared in JL Ross Lab at Syracuse University | NA | Stock Concentration: 8.87 μM in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Storage, Handling, Troubleshooting Notes: biotinylated dimers form kinesin clusters, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
NeutrAvidin Abbreviation used in paper: NA |
Thermo Fisher Scientific | 31000 | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM |
No 1. glass coverslips (24 mm x 24 mm) Abbreviation used in paper: coverslip |
Thermo Fisher Scientific | 12-548-CP | |
Paclitaxel Abbreviation used in paper: Taxol |
Thermo Fisher Scientific | P3456 | Stock Concentration: 2 mM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 200 μM in DMSO (0.4 μL in 3.6 μL DMSO) |
PEM-100 Abbreviation used in paper: PEM |
NA | NA | Stock Concentration: 1x Storage: room temperature (RT) Stock and Experiment Recipes: 100 mM K-PIPES (pH 6.8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: use KOH to adjust pH to 6.8, recheck pH often and adjust accordingly |
phalloidin Abbreviation used in paper: phalloidin |
Thermo Fisher Scientific | P3457 | Stock Concentration: 100 μM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC, adhere closely to storage/handling conditions Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: susceptible to impurities in its preparation and denaturing, identifiable as large amorphous aggregates of actin in samples |
porcine brain tubulin Abbreviation used in paper: tubulin |
Cytoskeleton | T240 | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
Potassium Chloride Abbreviation used in paper: KCl |
Thermo Fisher Scientific | AM9640G | Stock Concentration: 4 M Storage: RT |
Rabbit skeletal actin Abbreviation used in paper: actin |
Cytoskeleton | AKL99 | Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week |
Rabbit skeletal myosin II Abbreviation used in paper: myosin |
Cytoskeleton | MY02 | Stock Concentration: 10 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 10 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: monomers form minifilaments at low KCl, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
Tubulin (biotin): porcine brain Abbreviation used in paper: biotin-tubulin |
Cytoskeleton | T333P | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM |
Tubulin (fluorescent HiLyte 488): porcine brain Abbreviation used in paper: 488-tubulin |
Cytoskeleton | TL488M | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
tubulin (rhodamine): porcine brain Abbreviation used in paper: R-tubulin |
Cytoskeleton | TL590M | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
Tween 20 Abbreviation used in paper: Tween20 |
Thermo Fisher Scientific | J20605.AP | Stock Concentration: 1% v/v in DI H20 Storage: RT |
ultracentrifuge grade microtubes Abbreviation used in paper: Beckman-Coulter Optima Max XP |
Beckman Coultier | 343776 | Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 8×34 mm PC |
UV light curing glue Abbreviation used in paper: UV glue |
Pharda | SKG-2869 |