यह प्रोटोकॉल वयस्क मानव कॉर्टेक्स की दीर्घकालिक ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों का वर्णन करता है, जो प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कॉर्टिकल पूर्वजों के पूर्व विवो इंट्राकॉर्टिकल प्रत्यारोपण के साथ संयुक्त है, जो मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए स्टेम सेल-आधारित उपचारों का परीक्षण करने के लिए एक नई पद्धति प्रस्तुत करते हैं।
न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार उनके लक्षणों और सेलुलर प्रभाव के संदर्भ में आम और विषम हैं, जिससे उचित पशु मॉडल की कमी के कारण उनका अध्ययन जटिल हो जाता है जो पूरी तरह से मानव रोगों की नकल करते हैं और पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क ऊतक की खराब उपलब्धता। वयस्क मानव तंत्रिका ऊतक संस्कृति न्यूरोलॉजिकल विकारों के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करती है। आणविक, सेलुलर और जैव रासायनिक तंत्र को इस प्रणाली में आसानी से संबोधित किया जा सकता है, साथ ही दवाओं या विभिन्न उपचारों, जैसे सेल-आधारित उपचारों का परीक्षण और सत्यापन किया जा सकता है। यह विधि वयस्क मानव कॉर्टेक्स के दीर्घकालिक ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों को जोड़ती है, जो रिसेक्टिव सर्जरी से गुजरने वाले मिर्गी के रोगियों से प्राप्त होती है, और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कॉर्टिकल पूर्वजों के पूर्व विवो इंट्राकॉर्टिकल प्रत्यारोपण से प्राप्त होती है। यह विधि सेल अस्तित्व, न्यूरोनल भेदभाव, सिनैप्टिक इनपुट और आउटपुट के गठन और बरकरार वयस्क मानव कॉर्टिकल ऊतक में प्रत्यारोपण के बाद मानव-व्युत्पन्न कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों के अध्ययन की अनुमति देगी। यह दृष्टिकोण 3 डी मानव रोग मॉडलिंग प्लेटफॉर्म के विकास से पहले एक महत्वपूर्ण कदम है जो विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों वाले रोगियों के लिए स्टेम सेल-आधारित उपचारों के नैदानिक अनुवाद के करीब बुनियादी शोध लाएगा और क्षतिग्रस्त तंत्रिका सर्किट के पुनर्निर्माण के लिए नए उपकरणों के विकास की अनुमति देगा।
न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार, जैसे पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, या इस्केमिक स्ट्रोक, बीमारियों का एक समूह है जो न्यूरोनल खराबी या मृत्यु की सामान्य विशेषता साझा करता है। वे मस्तिष्क क्षेत्र और प्रभावित न्यूरोनल आबादी के संदर्भ में विषम हैं। दुर्भाग्य से, इन बीमारियों के लिए उपचार दुर्लभ हैं या पशु मॉडल की कमी के कारण सीमित प्रभावकारिता के हैं जो मानव मस्तिष्क 1,2 में होने वाली चीजों की नकल करते हैं। स्टेम सेल थेरेपीमस्तिष्क पुनर्जनन के लिए सबसे आशाजनक रणनीतियों में से एक है। विभिन्न स्रोतों से स्टेम कोशिकाओं से न्यूरोनल पूर्वजों की पीढ़ी हाल के वर्षों में बहुत विकसित हुईहै4,5. हाल के प्रकाशनों से पता चला है कि मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (आईपीएस) सेल-व्युत्पन्न दीर्घकालिक स्व-नवीनीकृत न्यूरोएपिथेलियल-जैसे स्टेम (एलटी-एनईएस) कोशिकाएं, एक कॉर्टिकल भेदभाव प्रोटोकॉल का पालन करते हुए और सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स को प्रभावित करने वाले इस्केमिक स्ट्रोक के साथ एक चूहे के मॉडल में इंट्राकॉर्टिकल प्रत्यारोपण के बाद, परिपक्व कॉर्टिकल न्यूरॉन्स उत्पन्न करती हैं। इसके अलावा, ग्राफ्ट-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स को मेजबान न्यूरॉन्स से अभिवाही और अपवाही सिनैप्टिक कनेक्शन प्राप्त हुए, जो चूहे के न्यूरोनल नेटवर्क 6,7 में उनके एकीकरण को दर्शाते हैं। ग्राफ्ट-व्युत्पन्न अक्षतंतु माइलिनेटेड थे और चूहे के मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में पाए गए थे, जिनमें पेरी-इन्फ्रैक्ट क्षेत्र, कॉर्पस कॉलोसम और विपरीत सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स शामिल थे। सबसे महत्वपूर्ण बात, आईपीएस सेल-व्युत्पन्न प्रत्यारोपण ने स्ट्रोक जानवरों में मोटर घाटे को उलट दिया।
यहां तक कि अगर पशु मॉडल प्रत्यारोपण अस्तित्व, न्यूरोनल एकीकरण और मोटर और संज्ञानात्मक कार्यों पर ग्राफ्टेड कोशिकाओं के प्रभाव का अध्ययन करने में मदद करते हैं, तो इस प्रणाली में मानव कोशिकाओं (ग्राफ्ट-होस्ट) के बीच बातचीत के बारे में जानकारी गायब है। इस कारण से, मानव आईपीएस सेल-व्युत्पन्न न्यूरोनल पूर्वजों के पूर्व विवो प्रत्यारोपण के साथ दीर्घकालिक मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति की एक संयुक्त विधि यहां वर्णित है। न्यूरोसर्जिकल रिसेक्शन से प्राप्त मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियां मस्तिष्क के शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी मॉडल हैं जो शोधकर्ताओं को मानव केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सर्किटरी की अपनी समझ बढ़ाने और मानव मस्तिष्क विकारों के लिए उपचार के परीक्षण का सबसे सटीक तरीका है। हालांकि, इस संदर्भ में पर्याप्त शोध नहीं किया गया है, और ज्यादातर मामलों में, मानव हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों का उपयोग10,11 किया गया है। सेरेब्रल कॉर्टेक्स कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों से प्रभावित होता है, जैसे कि इस्केमिक स्ट्रोक12 या अल्जाइमर रोग13, इसलिए मानव कॉर्टिकल 3 डी प्रणाली होना महत्वपूर्ण है जो हमें अपने ज्ञान का विस्तार करने और विभिन्न चिकित्सीय रणनीतियों का परीक्षण और मान्य करने की अनुमति देता है। पिछले कुछ वर्षों में कई अध्ययनों ने मानव मस्तिष्क रोगों को मॉडल करने के लिए वयस्क मानव कॉर्टिकल (एचएसीटीएक्स) ऊतक से संस्कृतियों का उपयोग किया है 14,15,16,17,18,19; हालांकि, स्टेम सेल थेरेपी के संदर्भ में सीमित जानकारी उपलब्ध है। दो अध्ययनों ने पहले ही यहां वर्णित प्रणाली की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है। 2018 में, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को विभिन्न प्रतिलेखन कारकों के साथ प्रोग्राम किया गया और एचएसीटीएक्स ऊतक में प्रत्यारोपित किया गया, जो परिपक्व कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को जन्म देने के लिए दिखाया गया था जो वयस्क मानव कॉर्टिकल नेटवर्क20 में एकीकृत हो सकते हैं। 2020 में, मानव ऑर्गेनोटाइपिक सिस्टम में एलटी-एनईएस कोशिकाओं के प्रत्यारोपण से कार्यात्मक न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों के साथ परिपक्व, परत-विशिष्ट कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में अंतर करने की उनकी क्षमता का पता चला। ग्राफ्टेड न्यूरॉन्स ने वयस्क मस्तिष्क स्लाइस में मानव कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के साथ अभिवाही और अपवाही सिनैप्टिक संपर्क दोनों स्थापित किए, जैसा कि रेबीज वायरस प्रतिगामी मोनोसिनेप्टिक ट्रेसिंग, पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और इम्यूनो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी21 द्वारा पुष्टि की गई है।
उच्च पर्याप्त गुणवत्ता के एचएसीटीएक्स स्लाइस प्राप्त करना इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। कॉर्टिकल ऊतक मिर्गी के रोगियों से प्राप्त किया जाता है जोउपचारात्मक सर्जरी से गुज…
The authors have nothing to disclose.
यह काम स्वीडिश रिसर्च काउंसिल, स्वीडिश ब्रेन फाउंडेशन, स्वीडिश स्ट्रोक फाउंडेशन, रीजन स्केन, द थोर्स्टन और एल्सा सेगरफेल्क फाउंडेशन और स्वीडिश गवर्नमेंट इनिशिएटिव फॉर स्ट्रैटेजिक रिसर्च एरियाज (स्टेमथेरेपी) से अनुदान द्वारा समर्थित है।
Tissue Cutting and electrophysiology | |||
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2×91 | |
Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
Plastic Petri dish | Any suitable | ||
Potassium chloride | Merck | 104936 | |
Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Vibratome | Leica | VT1200 S | |
RINSING SOLUTION | |||
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
Forceps | Any suitable | ||
Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
GENERATION OF lt-NES cells | |||
2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
Paint brush | Any suitable | ||
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
Distilled water | |||
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium citrate | |||
Distilled water | |||
Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |