Denne protokollen beskriver langsiktige organotypiske kulturer av voksen human cortex kombinert med ex vivo intrakortikal transplantasjon av induserte pluripotente stamcelleavledede kortikale progenitorer, som presenterer en ny metodikk for ytterligere å teste stamcellebaserte terapier for humane nevrodegenerative lidelser.
Neurodegenerative lidelser er vanlige og heterogene når det gjelder symptomer og cellulær påvirkning, noe som gjør studien komplisert på grunn av mangel på riktige dyremodeller som fullt ut etterligner menneskelige sykdommer og den dårlige tilgjengeligheten av menneskelig hjernevev etter døden. Voksen human nervevevskultur gir mulighet til å studere ulike aspekter av nevrologiske lidelser. Molekylære, cellulære og biokjemiske mekanismer kan lett adresseres i dette systemet, samt testing og validering av medisiner eller forskjellige behandlinger, for eksempel cellebaserte terapier. Denne metoden kombinerer langsiktige organotypiske kulturer av den voksne humane cortex, oppnådd fra epileptiske pasienter som gjennomgår resektiv kirurgi, og ex vivo intrakortikal transplantasjon av induserte pluripotente stamcelleavledede kortikale progenitorer. Denne metoden vil tillate studier av celleoverlevelse, nevrondifferensiering, dannelse av synaptiske innganger og utganger, og de elektrofysiologiske egenskapene til humanavledede celler etter transplantasjon i intakt voksent humant kortikalt vev. Denne tilnærmingen er et viktig skritt før utviklingen av en 3D-modelleringsplattform for menneskelig sykdom som vil bringe grunnforskning nærmere den kliniske oversettelsen av stamcellebaserte terapier for pasienter med forskjellige nevrologiske lidelser og tillate utvikling av nye verktøy for å rekonstruere skadede nevrale kretser.
Neurodegenerative lidelser, som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom eller iskemisk slag, er en gruppe sykdommer som deler fellestrekk ved nevronfeil eller død. De er heterogene når det gjelder hjerneområdet og nevronpopulasjonen som er berørt. Dessverre er behandlinger for disse sykdommene knappe eller av begrenset effekt på grunn av mangel på dyremodeller som etterligner det som skjer i den menneskelige hjerne 1,2. Stamcelleterapi er en av de mest lovende strategiene for hjernens regenerering3. Genereringen av nevronale forfedre fra stamceller fra forskjellige kilder har blitt sterkt utviklet de siste årene 4,5. Nylige publikasjoner har vist at humane induserte pluripotente stamme (iPS) celleavledede langsiktige selvfornyende neuroepithelial-lignende stammeceller (lt-NES), etter en kortikal differensieringsprotokoll og etter intrakortikal transplantasjon i en rottemodell med iskemisk hjerneslag som påvirker den somatosensoriske cortex, genererer modne kortikale nevroner. I tillegg mottok de transplantatavledede nevronene afferente og efferente synaptiske forbindelser fra vertsnevronene, som viser deres integrasjon i rotteneuronnettverket 6,7. De transplantatavledede aksonene ble myeliniserte og funnet i forskjellige områder av rottehjernen, inkludert peri-infarktområdet, corpus callosum og kontralateral somatosensorisk cortex. Viktigst av alt, iPS-celleavledet transplantasjon reverserte motoriske underskudd hos slagdyr7.
Selv om dyremodeller bidrar til å studere transplantasjonsoverlevelse, nevronintegrasjon og effekten av de transplanterte cellene på motoriske og kognitive funksjoner, mangler informasjon om interaksjon mellom humane celler (graft-host) i dette systemet 8,9. Av denne grunn er en kombinert metode for langsiktig human hjerneorganotypisk kultur med ex vivo-transplantasjon av humane iPS-celleavledede nevronale progenitorer beskrevet her. Menneskelige hjerneorganotypiske kulturer hentet fra nevrokirurgiske reseksjoner er fysiologisk relevante 3D-modeller av hjernen som tillater forskere å øke forståelsen av menneskets sentralnervesystemkretsløp og den mest nøyaktige måten å teste behandlinger for humane hjernesykdommer. Imidlertid har det ikke blitt gjort nok forskning i denne sammenhengen, og i de fleste tilfeller har menneskelige hippocampus-hjerneorganotypiske kulturer blitt brukt10,11. Hjernebarken påvirkes av flere neurodegenerative lidelser, som iskemisk slag12 eller Alzheimers sykdom13, så det er viktig å ha et humant kortikal 3D-system som gjør at vi kan utvide vår kunnskap og teste og validere ulike terapeutiske strategier. Flere studier de siste årene har brukt kulturer fra voksent humant kortikalt (hACtx) vev for å modellere menneskelige hjernesykdommer 14,15,16,17,18,19; Imidlertid er begrenset informasjon tilgjengelig i sammenheng med stamcellebehandling. To studier har allerede vist gjennomførbarheten av systemet beskrevet her. I 2018 ble humane embryonale stamceller programmert med forskjellige transkripsjonsfaktorer og transplantert i hACtx-vev vist å gi opphav til modne kortikale nevroner som kunne integreres i voksne humane kortikale nettverk20. I 2020 avslørte transplantasjonen av lt-NES-celler i det humane organotypiske systemet deres evne til å differensiere til modne, lagspesifikke kortikale nevroner med de elektrofysiologiske egenskapene til funksjonelle nevroner. De podede nevronene etablerte både afferente og efferente synaptiske kontakter med de humane kortikale nevronene i de voksne hjerneskivene, som bekreftet av rabiesvirus retrograd monosynaptisk sporing, helcellelapp-klemmeopptak og immunelektronmikroskopi21.
Å skaffe hACtx-skiver av høy nok kvalitet er det mest kritiske trinnet i denne protokollen. Kortikalt vev er hentet fra epileptiske pasienter som gjennomgår resektiv kirurgi24. Kvaliteten på resektert vev, samt eksponeringstiden for vevet mellom reseksjon og kultur, er kritisk; Jo raskere vevet overføres fra operasjonsrommet til laboratoriet og kuttes, desto mer optimal blir den organotypiske kulturen. Ideelt sett bør vevet kuttes og overføres til cellekulturlaboratoriet i…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av tilskudd fra Vetenskapsrådet, den svenske hjernefonden, den svenske Stroke Foundation, Region Skåne, Thorsten og Elsa Segerfalk Foundation, og den svenske regjeringens initiativ for strategiske forskningsområder (StemTherapy).
Tissue Cutting and electrophysiology | |||
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2×91 | |
Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
Plastic Petri dish | Any suitable | ||
Potassium chloride | Merck | 104936 | |
Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Vibratome | Leica | VT1200 S | |
RINSING SOLUTION | |||
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
Forceps | Any suitable | ||
Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
GENERATION OF lt-NES cells | |||
2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
Paint brush | Any suitable | ||
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
Distilled water | |||
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium citrate | |||
Distilled water | |||
Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |