रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करके एक्सोन्यूक्लिज़-कमी सेलुलर अर्क से सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण
Summary
यहां प्रस्तुत एस्चेरिचिया कोलाई बीएल 21 रोसेटा 2 के एक्सोन्यूक्लिज़ वी नॉकआउट उपभेदों से सेल अर्क की तैयारी और बफर अंशांकन के लिए एक प्रोटोकॉल है। यह रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करके सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रणालियों में अभिव्यक्ति के लिए एक तेज़, आसान और प्रत्यक्ष दृष्टिकोण है।
Abstract
सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) हाल ही में अपने कई फायदों के कारण सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र में बहुत लोकप्रिय हो गया है। सीएफपीएस के लिए रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करने से तकनीक को अपनी पूरी क्षमता तक पहुंचने में मदद मिलेगी, क्लोनिंग, परिवर्तन और प्लास्मिड निष्कर्षण के चरणों को समाप्त करके प्रयोगात्मक समय कम हो जाएगा। रैखिक डीएनए को पीसीआर द्वारा टेम्पलेट की उच्च सांद्रता प्राप्त करने के लिए तेजी से और आसानी से प्रवर्धित किया जा सकता है, जिससे विवो अभिव्यक्ति विषाक्तता में क्षमता से बचा जा सकता है। हालांकि, रैखिक डीएनए टेम्प्लेट तेजी से एक्सोन्यूक्लिज़ द्वारा अवक्रमित होते हैं जो स्वाभाविक रूप से सेल अर्क में मौजूद होते हैं। इस समस्या से निपटने के लिए कई रणनीतियों का प्रस्ताव किया गया है, जैसे कि न्यूक्लियस इनहिबिटर जोड़ना या सुरक्षा के लिए रैखिक डीएनए छोरों का रासायनिक संशोधन। इन सभी रणनीतियों में अतिरिक्त समय और संसाधन खर्च होते हैं और अभी तक प्रोटीन अभिव्यक्ति के निकट-प्लास्मिड स्तर प्राप्त नहीं हुए हैं। सीएफपीएस के लिए रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। एक्सोन्यूक्लिज़-कमी नॉकआउट कोशिकाओं से सेल अर्क का उपयोग करके, रैखिक डीएनए टेम्प्लेट किसी भी अंत-संशोधन की आवश्यकता के बिना बरकरार रहते हैं। हम विशेष रूप से रैखिक डीएनए के लिए एमजी-ग्लूटामेट (एमजी-ग्लू) और के-ग्लूटामेट (के-ग्लू) के लिए सोनिकेशन लाइसिस और बफर अंशांकन द्वारा एस्चेरिचिया कोलाई बीएल 21 रोसेट 2 आरईसीबीसीडी स्ट्रेन से सेल लाइसेट की तैयारी चरणों को प्रस्तुत करते हैं। यह विधि ई कोलाई सीएफपीएस में प्लास्मिड डीएनए से तुलनीय प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर प्राप्त करने में सक्षम है।
Introduction
सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) सिस्टम का उपयोग तेजी से बायोसेंसर इंजीनियरिंग,विकेंद्रीकृत विनिर्माण और आनुवंशिक सर्किट के प्रोटोटाइप के लिए एक तेज, सरल और कुशल विधि के रूप में किया जा रहा है। उनकी महान क्षमता के कारण, सीएफपीएस सिस्टम का उपयोग सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र में नियमित रूप से किया जाता है। हालांकि, अब तक सीएफपीएस सिस्टम परिपत्र प्लास्मिड पर भरोसा करते हैं जो तकनीक को अपनी पूरी क्षमता तक पहुंचने से सीमित कर सकते हैं। प्लास्मिड डीएनए तैयार करना क्लोनिंग और बड़ी मात्रा में डीएनए अलगाव के दौरान कई समय लेने वाले चरणों पर निर्भर करता है। दूसरी ओर, प्लास्मिड, या एक संश्लेषित डीएनए टेम्पलेट से पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग कुछ घंटों के भीतर सीएफपीएस टेम्पलेट्स तैयार करनेके लिए किया जा सकता है। इसलिए, रैखिक डीएनए का अनुप्रयोग सीएफपीएस के लिए एक आशाजनक समाधान प्रदान करता है। हालांकि, सेलुलर अर्क4 में स्वाभाविक रूप से मौजूद एक्सोन्यूक्लिज़ द्वारा रैखिक डीएनए तेजी से अवक्रमित होता है। ऐसे समाधान हैं जो इस समस्या को संबोधित करते हैं, जैसे कि सुरक्षात्मक एजेंटों के रूप में ची साइट6 युक्त λ-phage GamS प्रोटीन5 या डीएनए का उपयोग करना, या सीधे इसके सिरों 2,7,8,9 के रासायनिक संशोधन द्वारा रैखिक डीएनए की रक्षा करना। इन सभी विधियों को सेल निकालने के लिए पूरक की आवश्यकता होती है, जो महंगा और समय लेने वाला होता है। यह लंबे समय से ज्ञात है कि एक्सोन्यूक्लिज़ वी कॉम्प्लेक्स (आरईसीबीडी) सेल लाइसेट4 में रैखिक डीएनए को नीचा दिखाता है। हाल ही में, हमने दिखाया कि रैखिक डीएनए को एक्सोन्यूक्लिज़ जीन (आरईसीबीडी) 10 के लिए नॉक की गई कोशिकाओं से लाइसेट में बेहतर संरक्षित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, सोनिकेशन लाइसिस द्वारा ई कोलाई बीएल 21 रोसेटा 2 से सेल-मुक्त लाइसेट की तैयारी के लिए चरणों का विस्तार से वर्णन किया गया है। सोनिकेशन लाइसिस एक सामान्य और सस्ती तकनीक है जो कई प्रयोगशालाओं11,12 द्वारा नियोजित है। इस तनाव से उत्पादित अर्क को रैखिक डीएनए टेम्प्लेट से अभिव्यक्ति का समर्थन करने के लिए किसी भी अतिरिक्त घटक या डीएनए टेम्पलेट संशोधन के अतिरिक्त की आवश्यकता नहीं है। विधि विशेष रूप से देशी ई कोलाई प्रमोटरों से रैखिक डीएनए अभिव्यक्ति के लिए सेल अर्क के लिए बफर अनुकूलन के आवश्यक चरण पर निर्भर करती है। यह दिखाया गया है कि रैखिक डीएनए अभिव्यक्ति के लिए यह विशिष्ट बफर अनुकूलन देशी 70 प्रमोटरों के लिए जीएएमएस प्रोटीन या ची डीएनए पूरकता के बिना उच्च प्रोटीन उत्पादन प्राप्त करने की कुंजी है, यहां तक कि पीसीआर उत्पादोंके शुद्धिकरण से भी बचता है। रैखिक डीएनए अभिव्यक्ति के लिए एमजी-ग्लू की इष्टतम एकाग्रता प्लास्मिड डीएनए के समान पाई गई। हालांकि, के-ग्लू की इष्टतम एकाग्रता ने रैखिक और प्लास्मिड डीएनए के बीच पर्याप्त अंतर दिखाया, संभवतः प्रतिलेखन से संबंधित तंत्र10 के कारण। इस विधि का उपयोग करके व्यक्त प्रोटीन की कार्यक्षमता को कई अनुप्रयोगों के लिए प्रदर्शित किया गया है, जैसे कि टोहोल्ड स्विच की तेजी से स्क्रीनिंग और एंजाइम वेरिएंट10 का गतिविधि मूल्यांकन।
यह प्रोटोकॉल ई कोलाई सेल-मुक्त प्रणालियों में रैखिक डीएनए टेम्प्लेट का उपयोग करने के लिए एक सरल, कुशल और लागत प्रभावी समाधान प्रदान करता है, बस टेम्पलेट के रूप में रैखिक डीएनए के लिए उत्परिवर्ती 1रिक बीसीडी सेल अर्क और विशिष्ट अंशांकन का उपयोग करके।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम दिखाते हैं कि ई कोलाई बीएल 21 रोसेटा 2 से तैयार सेल लाइसेट या तो आरईसीबी या आरईसीसीडी ऑपेरॉन के लिए जीनोमिक नॉकआउट के साथ रैखिक डीएनए टेम्पलेट्स से उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति का समर्थन करता ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एसीबी और जेएलएफ एएनआर सिनापयूवी अनुदान (एएनआर-17-सीई07-0046) द्वारा वित्त पोषण सहायता स्वीकार करते हैं। जेएलएफ और जेबी एएनआर सिंबायोडायग अनुदान (एएनआर-18-सीई 33-0015) द्वारा वित्त पोषण सहायता स्वीकार करते हैं। एमएसए और जेएलएफ एएनआर आईसीफ्री अनुदान (एएनआर -20-बायोपएनएसई) द्वारा वित्त पोषण सहायता स्वीकार करते हैं। जेबी “COMPUCELL” (अनुदान संख्या 657579) शुरू करने वाले ईआरसी से समर्थन स्वीकार करता है। सेंटर डी बायोचीमी स्ट्रक्चरल स्ट्रक्चरल एकीकृत संरचनात्मक जीवविज्ञान (एफआरआईएसबी) (एएनआर -10-आईएनएसबी-05-01) के लिए फ्रेंच इंफ्रास्ट्रक्चर से समर्थन स्वीकार करता है। एमके ने आईएनआरएई के एमआईसीए विभाग, यूनिवर्सिट पेरिस-सैकले, इले-डी-फ्रांस (आईडीएफ) क्षेत्र के डीआईएम-आरएफएसआई और एएनआर ड्रीमी (एएनआर -21-सीई 48-003) से वित्त पोषण सहायता स्वीकार की। इस काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद समेकितकर्ता पुरस्कार (सीएलबी के 865973) के माध्यम से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
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