Cellefri proteinsyntese fra eksonuklease-mangelfulle cellulære ekstrakter ved bruk av lineære DNA-maler
Summary
Presentert her er en protokoll for fremstilling og bufferkalibrering av celleekstrakter fra eksonuklease V knockout-stammer av Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD og ΔrecB). Dette er en rask, enkel og direkte tilnærming for ekspresjon i cellefrie proteinsyntesesystemer ved hjelp av lineære DNA-maler.
Abstract
Cellefri proteinsyntese (CFPS) har nylig blitt svært populær innen syntetisk biologi på grunn av sine mange fordeler. Bruk av lineære DNA-maler for CFPS vil ytterligere gjøre det mulig for teknologien å nå sitt fulle potensial, redusere eksperimenttiden ved å eliminere trinnene for kloning, transformasjon og plasmidekstraksjon. Lineært DNA kan raskt og enkelt forsterkes ved PCR for å oppnå høye konsentrasjoner av malen, og unngår potensiell in vivo ekspresjonstoksisitet. Imidlertid nedbrytes lineære DNA-maler raskt av eksonukleaser som er naturlig tilstede i celleekstraktene. Det er flere strategier som har blitt foreslått for å takle dette problemet, for eksempel å legge til nukleasehemmere eller kjemisk modifikasjon av lineære DNA-ender for beskyttelse. Alle disse strategiene koster ekstra tid og ressurser og har ennå ikke oppnådd nær-plasmidnivåer av proteinuttrykk. En detaljert protokoll for en alternativ strategi presenteres her for bruk av lineære DNA-maler for CFPS. Ved å bruke celleekstrakter fra eksonuklease-mangelfulle knockoutceller, forblir lineære DNA-maler intakte uten å kreve noen sluttmodifikasjoner. Vi presenterer forberedelsestrinnene av cellelysat fra Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stamme ved sonikeringslyse og bufferkalibrering for Mg-glutamat (Mg-glu) og K-glutamat (K-glu) spesielt for lineært DNA. Denne metoden er i stand til å oppnå proteinuttrykksnivåer som er sammenlignbare med det fra plasmid-DNA i E. coli CFPS.
Introduction
Cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS) brukes i økende grad som en rask, enkel og effektiv metode for biosensorteknikk, desentralisert produksjon og prototyping av genetiske kretser1. På grunn av deres store potensial brukes CFPS-systemer regelmessig innen syntetisk biologi. Men så langt er CFPS-systemer avhengige av sirkulære plasmider som kan begrense teknologien fra å nå sitt fulle potensial. Forberedelse av plasmid-DNA avhenger av mange tidkrevende trinn under kloning og store mengder DNA-isolasjon. På den annen side kan PCR-forsterkning fra et plasmid, eller en syntetisert DNA-mal, brukes til å bare forberede CFPS-maler innen få timer 2,3. Derfor tilbyr anvendelse av lineært DNA en lovende løsning for CFPS. Imidlertid nedbrytes lineært DNA raskt av eksonukleaser som er naturlig tilstede i cellulære ekstrakter4. Det finnes løsninger som løser dette problemet, for eksempel bruk av λ-GamS-protein5 eller DNA som inneholder Chi-steder6 som beskyttelsesmidler, eller direkte beskyttelse av det lineære DNA ved kjemisk modifisering av endene 2,7,8,9. Alle disse metodene krever tilskudd til celleekstraktet, som er kostbart og tidkrevende. Det har lenge vært kjent at eksonuklease V-komplekset (RecBCD) nedbryter lineært DNA i cellelysater4. Nylig viste vi at lineært DNA kan beskyttes mye bedre i lysater fra celler slått ut for eksonukleasegener (recBCD)10.
I denne protokollen er trinn for fremstilling av cellefrie lysater fra E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stammen ved sonikeringslyse beskrevet i detalj. Sonikeringslyse er en vanlig og rimelig teknikk som brukes av flere laboratorier11,12. Ekstraktene produsert fra denne stammen trenger ikke tillegg av noen ekstra komponent- eller DNA-malmodifisering for å støtte uttrykk fra lineære DNA-maler. Metoden er avhengig av det essensielle trinnet i bufferoptimalisering for celleekstrakter spesielt for lineært DNA-uttrykk fra innfødte E. coli-promotorer. Det har vist seg at denne spesifikke bufferoptimaliseringen for lineær DNA-ekspresjon er nøkkelen for innfødte σ70-promotorer for å gi høy proteinproduksjon uten GamS-protein eller Chi DNA-tilskudd, til og med unngå rensing av PCR-produktene10. Den optimale konsentrasjonen av Mg-glu for lineær DNA-ekspresjon ble funnet å være lik den for plasmid-DNA. Den optimale konsentrasjonen av K-glu viste imidlertid en betydelig forskjell mellom lineært og plasmid-DNA, sannsynligvis på grunn av en transkripsjonsrelatert mekanisme10. Funksjonaliteten til proteiner uttrykt ved hjelp av denne metoden har blitt demonstrert for flere applikasjoner, for eksempel rask screening av tåholdbrytere og aktivitetsvurdering av enzymvarianter10.
Denne protokollen gir en enkel, effektiv og kostnadseffektiv løsning for bruk av lineære DNA-maler i E. coli-cellefrie systemer ved ganske enkelt å bruke mutante ΔrecBCD-celleekstrakter og spesifikk kalibrering for lineært DNA som mal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi at cellelysat fremstilt fra E. coli BL21 Rosetta2 med en genomisk knockout for enten recB – eller recBCD-operon støtter høyt proteinuttrykk fra lineære DNA-maler . Denne protokollen utdyper en trinnvis lysatkalibreringsprosedyre som er spesifikk for lineære DNA-maler (figur 2), som er et kritisk trinn som fører til at det høye uttrykket fra σ70-promotorer i lineært DNA, når nærplasmidnivåer for ekvimolære DNA-konsentrasjoner. Denne protokol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB og JLF anerkjenner finansieringsstøtte fra ANR SINAPUV-tilskuddet (ANR-17-CE07-0046). JLF og JB anerkjenner finansieringsstøtte fra ANR SynBioDiag-tilskuddet (ANR-18-CE33-0015). MSA og JLF anerkjenner finansieringsstøtte fra ANR iCFree-tilskuddet (ANR-20-BiopNSE). JB anerkjenner støtte fra ERC som starter “COMPUCELL” (tilskuddsnummer 657579). Centre de Biochimie Structurale anerkjenner støtte fra den franske infrastrukturen for integrert strukturbiologi (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK anerkjenner finansieringsstøtte fra INRAes MICA-avdeling, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) -regionens DIM-RFSI og ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Dette arbeidet ble støttet med finansiering gjennom European Research Council Consolidator Award (865973 til CLB).
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
- Schinn, S. -. M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
- Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
- Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
- Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
