Cellfri proteinsyntes från exonukleas-bristfälliga cellulära extrakt med linjära DNA-mallar
Summary
Här presenteras ett protokoll för beredning och buffertkalibrering av cellextrakt från exonukleas V knockout-stammar av Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD och ΔrecB). Detta är ett snabbt, enkelt och direkt tillvägagångssätt för uttryck i cellfria proteinsyntessystem med linjära DNA-mallar.
Abstract
Cellfri proteinsyntes (CFPS) har nyligen blivit mycket populär inom syntetisk biologi på grund av dess många fördelar. Att använda linjära DNA-mallar för CFPS kommer ytterligare att göra det möjligt för tekniken att nå sin fulla potential, vilket minskar experimenttiden genom att eliminera stegen för kloning, transformation och plasmidextraktion. Linjärt DNA kan snabbt och enkelt förstärkas med PCR för att erhålla höga koncentrationer av mallen, vilket undviker potentiell toxicitet i vivo-uttryck . Linjära DNA-mallar bryts dock snabbt ned av exonukleas som finns naturligt i cellextrakten. Det finns flera strategier som har föreslagits för att hantera detta problem, såsom att lägga till nukleashämmare eller kemisk modifiering av linjära DNA-ändar för skydd. Alla dessa strategier kostar extra tid och resurser och har ännu inte fått nästan plasmidnivåer av proteinuttryck. Ett detaljerat protokoll för en alternativ strategi presenteras här för att använda linjära DNA-mallar för CFPS. Genom att använda cellextrakt från exonukleasbristfälliga knockout-celler förblir linjära DNA-mallar intakta utan att kräva några slutmodifieringar. Vi presenterar beredningsstegen för celllysat från Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD stam genom ultraljudsbehandling lysis och buffertkalibrering för Mg-glutamat (Mg-glu) och K-glutamat (K-glu) specifikt för linjärt DNA. Denna metod kan uppnå proteinuttrycksnivåer som är jämförbara med det från plasmid-DNA i E. coli CFPS.
Introduction
Cellfria proteinsyntessystem (CFPS) används alltmer som en snabb, enkel och effektiv metod för biosensorteknik, decentraliserad tillverkning och prototyper av genetiska kretsar1. På grund av sin stora potential används CFPS-system regelbundet inom syntetisk biologi. Hittills är CFPS-system dock beroende av cirkulära plasmider som kan begränsa tekniken från att nå sin fulla potential. Förberedelse av plasmid-DNA beror på många tidskrävande steg under kloning och stora mängder DNA-isolering. Å andra sidan kan PCR-förstärkning från en plasmid, eller en syntetiserad DNA-mall, användas för att helt enkelt förbereda CFPS-mallar inom några timmar 2,3. Därför erbjuder applicering av linjärt DNA en lovande lösning för CFPS. Linjärt DNA bryts emellertid snabbt ned av exonukleaser som finns naturligt i cellulära extrakt4. Det finns lösningar som löser detta problem, såsom att använda λ-GamS-proteinet5 eller DNA som innehåller Chi-platser6 som skyddsmedel, eller direkt skydda det linjära DNA genom kemisk modifiering av dess ändar 2,7,8,9. Alla dessa metoder kräver tillskott till cellextraktet, som är kostsamma och tidskrävande. Det har länge varit känt att exonukleas V-komplexet (RecBCD) bryter ner linjärt DNA i celllysater4. Nyligen visade vi att linjärt DNA kan skyddas mycket bättre i lysater från celler som slås ut för exonukleasgener (recBCD)10.
I detta protokoll beskrivs steg för beredning av cellfria lysater från E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD stam genom ultraljudsbehandling lysis i detalj. Ultraljudsbehandling lys är en vanlig och prisvärd teknik som används av flera laboratorier11,12. Extrakten som produceras från denna stam behöver inte tillsättas någon extra komponent eller DNA-mallmodifiering för att stödja uttryck från linjära DNA-mallar. Metoden bygger på det väsentliga steget för buffertoptimering för cellextrakt specifikt för linjärt DNA-uttryck från infödda E. coli-promotorer. Det har visats att denna specifika buffertoptimering för linjärt DNA-uttryck är nyckeln för infödda σ70-promotorer att ge hög proteinproduktion utan GamS-protein eller Chi-DNA-tillskott, till och med undvika rening av PCR-produkterna10. Den optimala koncentrationen av Mg-glu för linjärt DNA-uttryck visade sig likna den för plasmid-DNA. Den optimala koncentrationen av K-glu visade emellertid en väsentlig skillnad mellan linjärt och plasmid-DNA, sannolikt på grund av en transkriptionsrelaterad mekanism10. Funktionaliteten hos proteiner som uttrycks med denna metod har visats för flera tillämpningar, såsom snabb screening av tåhållare och aktivitetsbedömning av enzymvarianter10.
Detta protokoll ger en enkel, effektiv och kostnadseffektiv lösning för att använda linjära DNA-mallar i E. coli-cellfria system genom att helt enkelt använda mutanta ΔrecBCD-cellextrakt och specifik kalibrering för linjärt DNA som mall.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här visar vi att celllysat framställt från E. coli BL21 Rosetta2 med en genomisk knockout för antingen recB- eller recBCD-operon stöder högproteinuttryck från linjära DNA-mallar. Detta protokoll utarbetar ett steg-för-steg-lysatkalibreringsförfarande som är specifikt för linjära DNA-mallar (figur 2), vilket är ett kritiskt steg som leder till det höga uttrycket från σ70-promotorer i linjärt DNA och når nära plasmidnivåer för ekvimolära DNA-ko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB och JLF erkänner finansieringsstöd från ANR SINAPUV-bidraget (ANR-17-CE07-0046). JLF och JB erkänner finansieringsstöd från ANR SynBioDiag-bidraget (ANR-18-CE33-0015). MSA och JLF erkänner finansieringsstöd från ANR iCFree-bidraget (ANR-20-BiopNSE). JB erkänner stöd från EFR som startar “COMPUCELL” (bidragsnummer 657579). Centre de Biochimie Structurale erkänner stöd från den franska infrastrukturen för integrerad strukturbiologi (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK erkänner finansieringsstöd från INRAe: s MICA-avdelning, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) regionens DIM-RFSI och ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Detta arbete stöddes genom finansiering genom European Research Council Consolidator Award (865973 till CLB).
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
References
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
- Schinn, S. -. M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
- Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
- Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
- Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
