नवजात एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टेरेमिया आइसोलेट्स के आंतों के ट्रांसकाइटोसिस का आकलन
Summary
एस्चेरिचिया कोलाई नवजात शिशुओं में सेप्सिस का कारण बनता है जो जन्म के समय बैक्टीरिया को निगलते हैं। ई कोलाई की आंत्र पथ से रक्तप्रवाह तक यात्रा करने की क्षमता में शामिल प्रक्रिया को खराब तरीके से समझा जाता है। यह इन विट्रो मॉडल आंतों के उपकला कोशिकाओं के माध्यम से यात्रा करने के लिए ई कोलाई उपभेदों की क्षमता का आकलन करता है।
Abstract
नवजात शिशु मातृ ई कोलाई उपभेदों को निगलते हैं जो प्रसव के समय के आसपास अपने आंत्र पथ को उपनिवेशित करते हैं। आंत में स्थानांतरित करने की क्षमता वाले ई कोलाई उपभेद नवजात शिशु के रक्तप्रवाह पर आक्रमण करते हैं, जिससे जीवन के लिए खतरा पैदा होता है। यहां प्रस्तुत पद्धति इन विट्रो में नवजात ई कोलाई बैक्टेरेमिया आइसोलेट्स के ट्रांसकाइटोसिस का आकलन करने के लिए अर्धपारगम्य आवेषण पर विकसित ध्रुवीकृत आंतों के उपकला कोशिकाओं का उपयोग करती है। यह विधि स्थापित टी 84 आंतों की सेल लाइन का उपयोग करती है जिसमें संगम करने और तंग जंक्शनों और डेस्मोसोम बनाने की क्षमता होती है। संगम तक पहुंचने के बाद, परिपक्व टी 84 मोनोलेयर ट्रांसएपिथेलियल प्रतिरोध (टीईईआर) विकसित करते हैं, जिसे वोल्टमीटर का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है। टीईईआर मान आंतों के मोनोलेयर में बैक्टीरिया सहित बाह्य घटकों की पैरासेलुलर पारगम्यता के साथ विपरीत रूप से सहसंबद्ध हैं। दूसरी ओर, बैक्टीरिया (ट्रांससाइटोसिस) का ट्रांससेलुलर मार्ग, आवश्यक रूप से टीईआर माप को नहीं बदलता है। इस मॉडल में, आंतों के मोनोलेयर में जीवाणु मार्ग को संक्रमण के बाद 6 घंटे तक निर्धारित किया जाता है, और पैरासेलुलर पारगम्यता की निगरानी के लिए टीईईआर के बार-बार माप किए जाते हैं। इसके अलावा, यह विधि ध्रुवीकृत उपकला में बैक्टीरियल ट्रांसकाइटोसिस के दौरान तंग जंक्शनों और अन्य सेल-टू-सेल आसंजन प्रोटीन में संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग जैसी तकनीकों के उपयोग की सुविधा प्रदान करती है। इस मॉडल का उपयोग उन तंत्रों के लक्षण वर्णन में योगदान देता है जिनके द्वारा आंतों के उपकला में नवजात ई कोलाई ट्रांससाइटोज बैक्टीरिया का उत्पादन करता है।
Introduction
एस्चेरिचिया कोलाई नवजात शिशुओं में प्रारंभिक सेप्सिस का सबसे आम कारणहै 1,2,3. नवजात ई कोलाई बैक्टेरेमिया की मृत्यु दर 40% तक पहुंच सकती है, और मेनिन्जाइटिस एक संभावित जटिलता है जो गंभीर न्यूरोडेवलपमेंटल विकलांगतासे जुड़ी है। नवजात शिशु द्वारा मातृ ई कोलाई उपभेदों का अंतर्ग्रहण नवजात बैक्टेरेमिया का उत्पादन कर सकता है; इस प्रक्रिया को पशु मॉडल 2,4 में दोहराया गया है। एक बार निगलने के बाद, रोगजनक बैक्टीरिया आंतों की बाधा के पार नवजात आंत लुमेन से यात्रा करते हैं और रक्तप्रवाह में प्रवेश करते हैं, जिससे सेप्टिसीमिया होता है। नवजात आक्रामक ई कोलाई उपभेद जो बैक्टेरेमिया का उत्पादन करते हैं, आंतों के उपकला कोशिकाओं पर आक्रमण करने की उनकी क्षमता में भिन्न होते हैं। हालांकि, आक्रमण के बाद आंतों के उपकला को ट्रांससाइटोस करने की उनकी क्षमता पूरी तरह से विशेषता नहीं है।
यह आंतों के ट्रांसकाइटोसिस मॉडल आंतों के उपकला में जीवाणु मार्ग का अनुकरण करने के लिए एक उपयोगी इन विट्रो विधि है। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधियों का समग्र लक्ष्य आंतों के उपकला को ट्रांससाइटोज करने के लिए नवजात ई कोलाई आइसोलेट्स की क्षमता की तुलना करना है। यहां वर्णित मॉडल टी 84 कोशिकाओं का उपयोग करता है, जो अमर मानव आंतों के एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाएं 6,7 हैं। टी 84 कोशिकाओं को दो अलग-अलग डिब्बों के साथ एक अर्धपारगम्य झिल्ली पर संगम के लिए उगाया जाता है। इस तकनीक का उपयोग करने का तर्क यह है कि, जैसा कि विवो में होता है, ये आंतों की कोशिकाएं ध्रुवीकृत होती हैं और परिपक्व तंग जंक्शन 6,8 विकसित करती हैं। झिल्ली के संपर्क में आने वाला पक्ष बेसल पक्ष बन जाता है। कोशिकाओं का विपरीत पक्ष एपिकल पक्ष बन जाता है, आंतों के लुमेन जैसा दिखता है जहां रोगजनकों का पालन होता है और आक्रमण होता है। ट्रांसवेल झिल्ली बैक्टीरिया के लिए पारगम्य है, लेकिन ध्रुवीकृत आंतों की कोशिकाएं तंग जंक्शन बनाती हैं, जो बैक्टीरिया पैरासेलुलर आंदोलनको खराब करती हैं। इस प्रकार, यह विधि ट्रांससेलुलर मार्ग सहित बैक्टीरियल ट्रांसकाइटोसिस की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए मानव सेल लाइन का उपयोग करके एक नियंत्रित इन विट्रो वातावरण का लाभ प्रदान करती है। जबकि आंतों के उपकला में बैक्टीरिया के ट्रांसकाइटोसिस की जांच करने के लिए अन्य तरीके मौजूद हैं, यहां प्रस्तुत ट्रांसवेल विधि अधिक आसानी और पहुंच प्रदान करती है। वैकल्पिक तकनीकें, जैसे कि उसिंग चैंबर सिस्टम में स्थापित पूर्व विवो नमूनों का उपयोग करना, उपलब्ध हैं। हालांकि, वे ऊतक नमूनों का उपयोग करते हैं जो आसानी से सुलभ नहीं हो सकते हैं, खासकर अगर शोध मानव शरीर विज्ञान10 का अध्ययन करने का इरादा रखता है। आंतों के ऑर्गेनोइड मेजबान-बैक्टीरियाइंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो विकल्प का एक और उदाहरण प्रस्तुत करते हैं। जबकि बैक्टीरियल ट्रांसकाइटोसिस का अध्ययन करने के लिए ट्रांसवेल सिस्टम में ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर का भी उपयोग किया जा सकता है, उन्हें स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और विकास और भेदभाव को प्रेरित करने के लिए विशिष्ट विकास कारकों के उपयोग की आवश्यकता होतीहै। इस प्रकार, उनका उपयोग अधिक समय लेने वाला है और इस पांडुलिपि में वर्णित ट्रांसवेल विधि की तुलना में अधिक लागत से जुड़ा हुआ है।
इस इन विट्रो ट्रांसवेल सिस्टम का उपयोग करके आंतों के उपकला में जीवाणु मार्ग का मूल्यांकन विभिन्न रोगजनकों के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इन अध्ययनों ने ध्रुवीकृत आंतों के उपकला13,14,15 में बैक्टीरिया के ट्रांसकाइटोसिस को चिह्नित करने के लिए टी 84 कोशिकाओं का उपयोग करके ट्रांसवेल सिस्टम की उपयोगिता को दिखाया है। हालांकि, बैक्टेरेमिया-उत्पादक नवजात ई कोलाई उपभेदों की ट्रांससाइटोसिस क्षमता की तुलना करने के लिए इस ट्रांसवेल विधि के आवेदन को विस्तार से वर्णित नहीं किया गया है। यह पांडुलिपि अन्य शोधकर्ताओं को एक मानक ट्रांसवेल प्रोटोकॉल प्रदान करती है जो विश्वसनीय और उपयोग करने में आसान है और इसके लिए संसाधनों की आवश्यकता नहीं होती है जो बहुत महंगे हैं।
आंतों के उपकला को ट्रांससाइटोस करने के लिए नवजात आक्रामक ई कोलाई उपभेदों की क्षमता की तुलना करने के लिए, आंतों के उपकला मोनोलेयर के एपिकल पक्ष को बैक्टीरिया कोशिकाओं की एक ज्ञात संख्या से संक्रमित किया जा सकता है। इनक्यूबेशन के बाद, उपकला के बेसल पक्ष पर माध्यम एकत्र किया जा सकता है और समय के साथ बैक्टीरियल ट्रांसकाइटोसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इस पांडुलिपि में, प्रस्तुत विधियों का उपयोग बैक्टेरेमिया के साथ अस्पताल में भर्ती नवजात शिशुओं से बरामद नवजात ई कोलाई नैदानिक उपभेदों की ट्रांसकाइटोसिस क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। ट्रांसकाइटोसिस अध्ययनों के लिए इन नवजात नैदानिक आइसोलेट्स के चयन के लिए समावेश मानदंड पहले 1,2,16 प्रकाशित किए गए हैं। जब इस विधि को विभिन्न ई कोलाई उपभेदों का उपयोग करके किया जाता है, तो उनकी ट्रांससाइटोसिस क्षमताओं की तुलना की जा सकती है। इस प्रक्रिया के माध्यम से, आंतों के ट्रांसकाइटोसिस मॉडल ई कोलाई के विषाणु कारकों को चिह्नित करने के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान करता है जो मल्टीस्टेप प्रक्रिया में योगदान करते हैं जो नवजात बैक्टेरेमिया के विकास में समाप्त होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह विधि गैस्ट्रोएंटरोलॉजी और संक्रामक रोग 20 में उपयोग की जाने वालीतकनीकों से ली गई है। आंतों के उपकला अवरोध के इन विट्रो मॉडल का उपयोग उन तंत्रों को स्पष्ट करने के लिए किया गया है जिनके द्व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को मिसौरी-कैनसस सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन विश्वविद्यालय द्वारा जारी सारा मॉरिसन छात्र अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
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