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Biochemistry

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

Published: July 19, 2022
doi:
10.3791/64243
, , , , ,
1Department of Chemical Engineering,Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab,University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering,Indian Institute of Science

Summary

ここでは、単一分子全反射蛍光(smTIRF)顕微鏡を使用して、人工混雑した脂質膜上の単一分子の結合、移動度、および組み立てを実行および分析するためのプロトコルが提示されます。

Abstract

細胞膜は、生体分子反応とシグナル伝達のための非常に混雑した環境です。それでも、タンパク質と脂質との相互作用を調べる ほとんどのin vitro 実験では、裸の二重膜を使用しています。このようなシステムは、膜に埋め込まれたタンパク質や糖鎖によるクラウディングの複雑さを欠いており、細胞膜表面に遭遇する関連する体積効果を排除しています。また、脂質二重層が形成される負に帯電したガラス表面は、膜貫通生体分子の自由な拡散を妨げる。ここでは、混雑した脂質膜の模倣物として十分に特徴付けられたポリマー脂質膜を紹介します。このプロトコルは、クラウダーを支持脂質二重層(SLB)に組み込むための一般化されたアプローチとして、ポリエチレングリコール(PEG)結合脂質を利用します。まず、単一分子実験を行うための顕微鏡スライドとカバーガラスの洗浄手順を紹介します。次に、PEG-SLBの特性評価と、単一分子トラッキングとフォトブリーチングを使用した生体分子の結合、拡散、および組み立ての単一分子実験を実行する方法について説明します。最後に、このプロトコルは、単一分子光退色分析を使用して、混雑した脂質膜上の細菌の細孔形成毒素Cytolysin A(ClyA)のナノポアアセンブリを監視する方法を示しています。サンプルデータセットを含むMATLABコードも含まれており、粒子追跡、拡散挙動の抽出、サブユニットカウントなどの一般的な分析の一部を実行します。

Introduction

細胞膜は非常に混雑した複雑なシステムです1。分子クラウディングは、タンパク質や脂質などの膜結合エンティティの拡散に大きな影響を与える可能性があります2,3,4。同様に、受容体二量体化や膜複合体のオリゴマー化のような脂質膜上の二分子反応は、クラウディングの影響を受けます5,6,7。クラウダーの性質、配置、および濃度は、いくつかの方法で膜結合、拡散性、およびタンパク質間相互作用を制御することができます8,9。細胞膜上の膜クラウディングを制御し、埋め込まれた生体分子への影響を解釈することは困難であるため、研究者は代替のin vitroシステムを確立しようと試みてきました10。

人工混雑膜の一般的なアプローチは、二重膜にポリマー(ポリエチレングリコール、PEGなど)グラフト脂質をドープすることです11,12。支持された脂質二重層(SLB)上のタンパク質と脂質のダイナミクスを視覚化する際に、これらのポリマーは、二重層を下にある支持体から効果的に持ち上げることにより、膜に埋め込まれた成分を下にある負に帯電した基板(ガラスなど)からさらに保護します。ポリマーのサイズおよび濃度を変化させることによって、分子クラウディングの程度、ならびに下にある固体支持体からのその分離を制御することができる13、14。これは明らかに、膜貫通生体分子がその活性を失う可能性があるポリマークッション15,16のない固体基質上に支持された脂質二重層よりも有利である17,18,19。さらに重要なことに、それは私たちが多くの膜プロセスにとって重要であるin vitroで細胞膜の混雑した環境を再現することを可能にします。

膜上に表面グラフトされたポリマーも、そのグラフト密度に応じてそれらの配置の変化を受ける12。低濃度では、それらは膜表面の上にキノコとして知られるエントロピーコイル状の配置のままである。濃度が増加するにつれて、それらは相互作用し始め、ほどけて伸びる傾向があり、最終的に膜21上に緻密なブラシ様の形成をもたらす。キノコからブラシレジームへの移行は非常に不均一であり、ポリマーの特性が不十分な条件で現れるため、ポリマーグラフト膜上の混雑には十分に特徴付けられた条件を使用することが重要です。最近の研究20と比較して、膜貫通生体分子の拡散輸送と活性を維持する混雑した膜組成を特定し、報告しています。

このプロトコルでは、PEG化脂質膜を生成する方法について説明し、ポリマー配置の2つの異なるレジーム(つまり、キノコとブラシ)での混雑を模倣するPEG密度の推奨事項を提供します。このプロトコルでは、これらの混雑した膜に埋め込まれた分子の単一分子結合、粒子追跡、および光退色データの取得と分析についても説明します。まず、徹底的な洗浄手順、イメージングチャンバーの組み立て、およびPEG-SLBの生成について説明します。次に、単一分子結合、粒子追跡、および光退色実験の詳細を提供します。第三に、i)相対的な結合親和性の抽出、ii)分子拡散の特徴付け、およびiii)膜上の単一分子の動画からのタンパク質集合体のサブユニットのカウントについて説明します。

このシステムを単一分子イメージングで特徴付けましたが、このプロトコルは、脂質膜に対する生体分子反応に対するクラウディングの影響を理解することに関心のあるすべての膜生物物理学者にとって有用です。全体として、混雑して支持された脂質二重層を作成するための堅牢なパイプラインと、それらに対して実施されるさまざまな単一分子アッセイ、および対応する分析ルーチンを紹介します。

Protocol

1. 1分子実験用スライド・カバーガラスの洗浄 イメージングチャンバーを組み立てる前に、カバーガラスとスライドの両方を清掃して準備します。ダイヤモンドコーティングされたドリルビット(直径0.5〜1 mm)を備えたボール盤を使用して、スライドガラスに複数のペアの穴を開けます。アクリル板を使用する場合は、 図1に示すように、レーザーカッ…

Representative Results

PEG化メンブレンへのClyAタンパク質の結合のモニタリングステップ4.5の後、結合速度論は、膜表面に結合する粒子の数を経時的にプロットすることによって推定される(ビデオ1)。ClyAタンパク質が5mol%のPEG2000脂質を含む膜に結合すると、粒子密度が増加し、飽和に達します(図5)。結合粒子(シアンの円)への指数関数的減衰適合は、膜結合の時定?…

Discussion

ここでは、膜埋め込み生体分子の混雑した環境を示す支持脂質二重層(SLB)の単一分子実験を示します。混雑した環境は排除された体積効果を生成し、生体分子反応の増強につながります1,2,39,40。ポリマーが主に二重層の外側の体積を占めるPEG脂質系の場合、この効果は大きなエクトドメインを持?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ClyAタンパク質の発現プラスミドを共有したベンジャミン・シューラー教授を認めています。本研究は、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム(RGP0047-2020)の支援を受けて行われました。

Materials

2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 – 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons
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Keywords: Single-molecule ImagingPolymer-crowded Lipid MembranesSupported Lipid BilayersMembrane Biomolecular ReactionsDiffusionAssemblyPOPCDOPE-PEG(2000)Small Unilamellar VesiclesSonicationMicrofluidic Imaging Chambers
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Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).
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