Her presenteres en protokoll for å utføre og analysere binding, mobilitet og montering av enkeltmolekyler på kunstige overfylte lipidmembraner ved bruk av enkeltmolekyl total intern refleksjonsfluorescens (smTIRF) mikroskopi.
Cellulære membraner er svært overfylte miljøer for biomolekylære reaksjoner og signalering. Likevel bruker de fleste in vitro-eksperimenter som undersøker proteininteraksjon med lipider nakne dobbeltlagsmembraner. Slike systemer mangler kompleksiteten ved trengsel av membraninnstøpte proteiner og glykaner og utelukker de tilknyttede volumeffektene som oppstår på cellulære membranoverflater. Også den negativt ladede glassoverflaten som lipid-dobbeltlagene dannes på, forhindrer fri diffusjon av transmembrane biomolekyler. Her presenterer vi en godt karakterisert polymer-lipidmembran som en etterligning for overfylte lipidmembraner. Denne protokollen benytter polyetylenglykol (PEG)-konjugerte lipider som en generalisert tilnærming for å inkorporere crowders i det støttede lipid dobbeltlaget (SLB). Først presenteres en rengjøringsprosedyre for mikroskopiske lysbilder og deksler for å utføre enkeltmolekyleksperimenter. Deretter diskuteres metoder for å karakterisere PEG-SLBene og utføre enkeltmolekyleksperimenter av binding, diffusjon og montering av biomolekyler ved bruk av enkeltmolekylsporing og fotobleking. Til slutt demonstrerer denne protokollen hvordan man overvåker nanopore-samlingen av bakteriell poredannende toksin Cytolysin A (ClyA) på overfylte lipidmembraner med enkeltmolekylær fotoblekingsanalyse. MATLAB-koder med eksempeldatasett er også inkludert for å utføre noen av de vanlige analysene som partikkelsporing, ekstrahering av diffusiv oppførsel og telling av underenheter.
Cellemembraner er svært overfylte og komplekse systemer1. Molekylær trenging kan ha en betydelig innvirkning på diffusjonen av membranbundne enheter som protein og lipider 2,3,4. På samme måte påvirkes bimolekylære reaksjoner på lipidmembraner som reseptordimerisering eller oligomerisering av membrankomplekser av trengsel 5,6,7. Naturen, konfigurasjonen og konsentrasjonen av crowders kan styre membranbindingen, diffusiviteten og protein-proteininteraksjonen på flere måter 8,9. Siden det er utfordrende å kontrollere membranbelastning på cellulære membraner og tolke dens innflytelse på innebygde biomolekyler, har forskere forsøkt å etablere alternative in vitro-systemer 10.
En populær tilnærming for kunstige overfylte membraner er doping av dobbeltlagsmembranene med polymer (som polyetylenglykol, PEG)-podede lipider11,12. Under visualisering av protein og lipiddynamikk på støttede lipid dobbeltlag (SLBer), beskytter disse polymerene i tillegg de membraninnebygde komponentene fra det underliggende negativt ladede substratet (for eksempel glass) ved effektivt å løfte dobbeltlaget bort fra den underliggende støtten. Ved å variere størrelsen og konsentrasjonen av polymeren, kan man kontrollere omfanget av molekylær trengsel, samt dens separasjon fra den underliggende faste støtten13,14. Dette er helt klart en fordel i forhold til lipid-dobbeltlag som støttes på faste underlag uten polymerputer15,16, hvor transmembrane biomolekyler kan miste sin aktivitet17,18,19. Enda viktigere, det tillater oss å rekapitulere det overfylte miljøet i cellemembranen in vitro, noe som er kritisk for mange membranprosesser.
Overflatetransplanterte polymerer på membraner gjennomgår også endringer i konfigurasjonen avhengig av deres podningstetthet12. Ved lave konsentrasjoner forblir de i en entropisk kveilet konfigurasjon, kjent som en sopp, over membranoverflaten. Med økende konsentrasjon begynner de å samhandle og har en tendens til å løsne og utvide seg, noe som til slutt gir en tett børstelignende formasjon på membranen21. Siden overgangen fra sopp til børsteregimet er svært heterogen og manifesterer seg i dårlig karakteriserte forhold av polymeren, er det viktig å bruke godt karakteriserte forhold for trengsel på polymertransplanterte membraner. Sammenlignet med en nylig studie20, identifiserer og rapporterer vi overfylte membransammensetninger som opprettholder diffusiv transport og aktivitet av transmembrane biomolekyler.
I denne protokollen diskuterer vi hvordan man genererer PEGylerte lipidmembraner og gir anbefalinger for PEG-tettheter som etterligner trengsel i to forskjellige regimer av polymerkonfigurasjon (nemlig sopp og børste). Protokollen beskriver også enkeltmolekylbinding, partikkelsporing og fotobleking av datainnsamling og analyse for molekyler innebygd i disse overfylte membranene. Først beskriver vi de grundige rengjøringstrinnene, montering av bildekammeret og generering av PEG-SLB-er. For det andre gir vi detaljer for enkeltmolekylbinding, partikkelsporing og fotoblekingseksperimenter. For det tredje diskuterer vi i) å trekke ut de relative bindingsaffinitetene, ii) karakterisere molekylær diffusjon og iii) telle underenheter i en proteinsamling fra filmer av enkeltmolekyler på membranen.
Mens vi karakteriserte dette systemet med enkeltmolekylavbildning, er protokollen nyttig for alle membranbiofysikere som er interessert i å forstå effekten av trengsel på biomolekylære reaksjoner på lipidmembraner. Samlet sett presenterer vi en robust rørledning for å lage overfylte og støttede lipid-dobbeltlag, sammen med forskjellige enkeltmolekylanalyser utført på dem og tilhørende analyserutiner.
Her demonstrerer vi enkeltmolekyleksperimenter på støttede lipid-dobbeltlag (SLB) som manifesterer et overfylt miljø for membraninnstøpte biomolekyler. Det overfylte miljøet genererer en ekskludert volumeffekt, noe som fører til forbedring av biomolekylære reaksjoner 1,2,39,40. For PEG-lipidsystemet, hvor polymeren primært opptar volumet utenfor dobbeltlaget, er denne effekten spesielt …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner prof. Benjamin Schuler for å dele uttrykket plasmid for ClyA-protein. Dette arbeidet ble støttet av Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).
2.5 ml Syringes | HMD Healthcare | Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin | Plastic syringe |
Acetone | Finar Chemicals | 10020LL025 | |
Acrylic Sheet | 2 mm thick | ||
Acrylic Sheet | BigiMall | 2 mm, Clear | |
Bath Sonicator | Branson | CPX-1800 | |
Calcium Chloride | |||
Chloroform | Sigma | 528730 | HPLC grade |
Cholesterol | Avanti | 700100 | |
Coplin Jar | Duran Wheaton Kimble | S6016 | 8 Slide Jar with Glass Cover |
Coverslips | VWR | 631-1574 | 24 mm X 50 mm |
Cy3-DNA Strand | IDT | GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3 |
|
Cyanine Dye (Cy3) | Cytiva Life Sciences | PA23001 | |
DiI | Invitrogen | D3911 | Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) |
DNA Connector Strand 1 | Sigma Aldrich | GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T |
|
DNA Connector Strand 2 | Sigma Aldrich | CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT |
|
DNA Tocopherol Strand | Biomers | Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA | |
DOPE-PEG2000 | Avanti | 880130 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
Double Sided Tape | 3M | LF93010LE | |
Drill Bits (Diamond Coated) | 0.5 – 1 mm | ||
Drilling Machine | Dremel | 220 | Workstation |
EMCCD | Andor | DU-897U-CS0-#BV | |
Fluorescence Beads | Invitrogen | F10720 | |
Glass Slides | Blue Star | Micro Slides, PIC-1 | |
Glass Vials | Sigma | 854190 | |
Hydrogen Peroxide | Lobachemie | 00182 | 30% Solution, AR Grade |
Labolene | Thermo-Fischer Scientific | Detergent | |
Laser 532 nm | Coherent | Sapphire | |
Laser Cutter | Universal Laser Systems | ILS12.75 | |
Lissamine Rhodamine DOPE | Avanti | 810150 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) |
Methanol | Finar Chemicals | 30932LL025 | |
Microscope | Olympus | IX81 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | 1X | ||
Plasma Cleaner | Harrick Plasma Inc | PDC-002 | |
POPC | Avanti | 850457 | 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine |
Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE1010 | High Pressure Syringe Pump |
PTFE Caps | Sigma | 27141 | |
PTFE Tubing | Cole-Parmer | WW-06417-21 | Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD |
Sulphuric Acid | SD Fine Chemicals | 98%, AR Grade | |
TIRF Objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | |
Vacuum Desiccator | Tarsons | ||
Vortex Mixer | Tarsons |