Determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica
Summary
El presente protocolo describe el uso de la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para analizar la cinética de asociación y disociación de la unión entre un aptámero de ADN y tetraciclina, incluida la preparación de muestras, los patrones de ejecución y las muestras, y la interpretación de los datos resultantes.
Abstract
La determinación de la afinidad y el comportamiento de unión entre un aptámero y su objetivo es el paso más crucial en la selección y el uso de un aptámero para su aplicación. Debido a las drásticas diferencias entre el aptámero y las moléculas pequeñas, los científicos deben esforzarse mucho en caracterizar sus propiedades de unión. La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es un enfoque poderoso para este propósito. ITC va más allá de determinar constantes de disociación (Kd) y puede proporcionar los cambios de entalpía y la estequiometría de unión de la interacción entre dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración, por lo que el proceso puede medir con sensibilidad la unión entre macromoléculas y sus pequeños objetivos. Aquí, el artículo presenta un procedimiento paso a paso de la medición ITC de un aptámero seleccionado con un objetivo pequeño, la tetraciclina. Este ejemplo demuestra la versatilidad de la técnica y su potencial para otras aplicaciones.
Introduction
Los aptámeros son fragmentos de ssDNA o ARN seleccionados a través de un proceso de evolución con alta afinidad y especificidad de unión a las dianas deseadas1,2, que pueden funcionar como elementos de reconocimiento avanzado o anticuerpos químicos 3,4,5. Por lo tanto, la afinidad y especificidad de unión de los aptámeros a sus objetivos juegan un papel crucial en la selección y aplicación de un aptámero, y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se ha utilizado ampliamente para estos fines de caracterización. Se han utilizado muchos enfoques para determinar la afinidad de los aptámeros, incluyendo ITC, resonancia de plasmones de superficie (SPR), titulación colorimétrica, termoforesis a microescala (MST) e interferometría de biocapa (BLI). Entre ellas, ITC es una de las últimas técnicas para determinar la asociación termodinámica y cinética de dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración 6,7. A diferencia de otros métodos, ITC puede ofrecer afinidad de unión, varios sitios de unión y asociación termodinámica y cinética (Figura 1A). A partir de estos parámetros iniciales, los cambios de energía libre de Gibbs y los cambios de entropía se determinan utilizando la siguiente relación:
ΔG = ΔH-TΔS
Eso significa que ITC ofrece un perfil termodinámico completo de la interacción molecular para dilucidar los mecanismos de unión (Figura 1B). Determinar la afinidad de unión para moléculas pequeñas con un aptámero es difícil debido a los tamaños drásticamente diferentes entre el aptámero y el objetivo. Mientras tanto, ITC puede proporcionar mediciones sensibles sin etiquetar e inmovilizar moléculas, lo que proporciona un medio para mantener la estructura natural del aptámero y el objetivo durante la medición. Con los atributos mencionados, ITC se puede utilizar como el método estándar para la caracterización de la unión entre un aptámero y objetivos pequeños.
Después de la selección por parte del grupo Gu, este aptámero se integró con diferentes plataformas, incluidos biosensores electroquímicos basados en aptámeros, un ensayo competitivo de aptámero ligado a enzimas y una placa de microtitulación, que puede lograr una detección de alto rendimiento de tetraciclina 8,9,10. Sin embargo, sus características de unión no se han dilucidado lo suficientemente bien como para elegir la plataforma adecuada8; vale la pena caracterizar la unión del aptámero a la tetraciclina utilizando ITC.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado aquí fue modificado de acuerdo con las instrucciones de TA Instruments y es suficiente para determinar la afinidad de unión y la termodinámica de muchos aptámeros y objetivos seleccionados en nuestro centro. Los pasos cruciales de este procedimiento incluyen el intercambio del tampón para tener un objetivo que coincida con el ligando, ejecutar muestras con los parámetros adecuados y encontrar el modelo de ajuste de unión apropiado para analizar los datos. El registro continuo de la liberació…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la financiación de investigación y desarrollo de Aptagen LLC.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
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