Determinando a associação termodinâmica e cinética de um aptamer de DNA e tetraciclina usando calorimetria de titulação isotérmica
Summary
O presente protocolo descreve o uso da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para analisar a cinética de associação e dissociação da ligação entre um aptâmero de DNA e tetraciclina, incluindo a preparação de amostras, padrões de corrida e amostras, e a interpretação dos dados resultantes.
Abstract
A determinação da afinidade de ligação e do comportamento entre um aptâmero e seu alvo é o passo mais crucial na seleção e uso de um aptâmero para aplicação. Devido às diferenças drásticas entre o aptâmero e as pequenas moléculas, os cientistas precisam se esforçar muito para caracterizar suas propriedades de ligação. A Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) é uma abordagem poderosa para esse fim. O ITC vai além da determinação de constantes de dissociação (Kd) e pode fornecer as alterações de entalpia e estequiometria de ligação da interação entre duas moléculas na fase de solução. Essa abordagem conduz a titulação contínua usando moléculas livres de rótulo e registra o calor liberado ao longo do tempo sobre os eventos de ligação produzidos por cada titulação, de modo que o processo possa medir sensivelmente a ligação entre as macromoléculas e seus pequenos alvos. Aqui, o artigo introduz um procedimento passo-a-passo da medição ITC de um aptâmero selecionado com um pequeno alvo, a tetraciclina. Este exemplo comprova a versatilidade da técnica e seu potencial para outras aplicações.
Introduction
Aptamers são fragmentos de ssDNA ou RNA selecionados através de um processo evolutivo com alta afinidade de ligação e especificidade aos alvos desejados1,2, que podem funcionar como elementos avançados de reconhecimento ou anticorpos químicos 3,4,5. Assim, a afinidade de ligação e especificidade dos aptâmeros aos seus alvos desempenham um papel crucial na seleção e aplicação de um aptâmero, e a Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) tem sido amplamente utilizada para esses fins de caracterização. Muitas abordagens têm sido usadas para determinar a afinidade dos aptâmeros, incluindo ITC, ressonância plasmônica de superfície (SPR), titulação colorimétrica, termoforese em microescala (MST) e interferometria de biocamada (BLI). Entre elas, a TIC é uma das mais recentes técnicas para determinar a associação termodinâmica e cinética de duas moléculas na fase de solução. Essa abordagem realiza titulação contínua utilizando moléculas livres de rótulo e registra calor liberado ao longo do tempo sobre os eventos de ligação produzidos por cada titulação 6,7. Ao contrário de outros métodos, o ITC pode oferecer afinidade de ligação, vários sítios de ligação e associação termodinâmica e cinética (Figura 1A). A partir desses parâmetros iniciais, as mudanças de energia livre de Gibbs e as mudanças de entropia são determinadas usando a seguinte relação:
ΔG = ΔH-TΔS
Isso significa que o ITC oferece um perfil termodinâmico completo da interação molecular para elucidar os mecanismos de ligação (Figura 1B). Determinar a afinidade de ligação para pequenas moléculas com um aptâmero é difícil devido aos tamanhos drasticamente diferentes entre o aptâmero e o alvo. Enquanto isso, o ITC pode fornecer medição sensível sem rotular e imobilizar moléculas, o que fornece um meio de manter a estrutura natural do aptâmero e do alvo durante a medição. Com os atributos mencionados, o ITC pode ser usado como o método padrão para a caracterização da ligação entre um aptâmero e pequenos alvos.
Após a seleção pelo grupo Gu, este aptâmero foi integrado com diferentes plataformas, incluindo biossensores eletroquímicos à base de aptâmeros, um ensaio de aptâmero ligado a enzimas competitivas e uma placa de microtitulação, que pode alcançar a detecção de alto rendimento de tetraciclina 8,9,10. No entanto, suas características vinculantes não foram elucidadas o suficiente para escolher a plataforma adequada8; vale a pena caracterizar a ligação do aptâmero à tetraciclina usando ITC.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui apresentado foi modificado de acordo com as instruções da TA Instruments e é suficiente para determinar a afinidade de ligação e termodinâmica de muitos aptâmeros e alvos selecionados em nosso centro. As etapas cruciais desse procedimento incluem a troca do buffer para ter um alvo correspondente ao ligante, a execução de amostras com parâmetros adequados e a localização do modelo de ajuste de ligação apropriado para analisar os dados. O registro contínuo da liberação de calor requer a elim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo Financiamento de Pesquisa e Desenvolvimento da Aptagen LLC.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
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