İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi Kullanılarak DNA Aptamer ve Tetrasiklinin Termodinamik ve Kinetik İlişkisinin Belirlenmesi
Summary
Bu protokol, numune hazırlama, çalışma standartları ve numuneler dahil olmak üzere bir DNA aptamer ve tetrasiklin arasındaki bağlanmanın ilişkisini ve ayrışma kinetiğini analiz etmek için İzotermal Titrasyon Kalorimetrisinin (ITC) kullanımını açıklamaktadır.
Abstract
Bir aptamer ile hedefi arasındaki bağlanma afinitesinin ve davranışının belirlenmesi, uygulama için bir aptamer seçilmesinde ve kullanılmasında en önemli adımdır. Aptamer ve küçük moleküller arasındaki ciddi farklılıklar nedeniyle, bilim adamlarının bağlanma özelliklerini karakterize etmek için çok çaba sarf etmeleri gerekir. İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi (ITC) bu amaç için güçlü bir yaklaşımdır. ITC, ayrışma sabitlerini (Kd) belirlemenin ötesine geçer ve çözelti fazındaki iki molekül arasındaki etkileşimin entalpi değişikliklerini ve bağlanma stokiyometrisini sağlayabilir. Bu yaklaşım, etiketsiz moleküller kullanarak sürekli titrasyon gerçekleştirir ve her bir titrasyonun ürettiği bağlanma olaylarına zaman içinde salınan ısıyı kaydeder, böylece süreç makromoleküller ile küçük hedefleri arasındaki bağlanmayı hassas bir şekilde ölçebilir. Bu makalede, küçük bir hedef olan tetrasiklin ile seçilen bir aptamerin ITC ölçümünün adım adım prosedürü tanıtılmaktadır. Bu örnek, tekniğin çok yönlülüğünü ve diğer uygulamalar için potansiyelini kanıtlamaktadır.
Introduction
Aptamerler, gelişmiş tanıma elementleri veya kimyasal antikorlar 3,4,5 olarak çalışabilen, istenen hedeflere 1,2 yüksek bağlanma afinitesi ve özgüllüğü olan bir evrim süreci ile seçilen ssDNA veya RNA fragmanlarıdır. Bu nedenle, aptamerlerin hedeflerine bağlanma afinitesi ve özgüllüğü, bir aptamer seçiminde ve uygulanmasında çok önemli bir rol oynamaktadır ve İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi (ITC) bu karakterizasyon amaçları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Apatimerlerin afinitesini belirlemek için ITC, yüzey plazmon rezonansı (SPR), kolorimetrik titrasyon, mikro ölçekli termoforez (MST) ve Biyo-Katman İnterferometrisi (BLI) dahil olmak üzere birçok yaklaşım kullanılmıştır. Bunlar arasında ITC, çözelti fazındaki iki molekülün termodinamik ve kinetik ilişkisini belirlemek için en son tekniklerden biridir. Bu yaklaşım, etiketsiz moleküller kullanarak sürekli titrasyon gerçekleştirir ve her bir titrasyon 6,7 tarafından üretilen bağlanma olaylarına zaman içinde salınan ısıyı kaydeder. Diğer yöntemlerden farklı olarak, ITC bağlanma afinitesi, çeşitli bağlanma bölgeleri ve termodinamik ve kinetik ilişki sunabilir (Şekil 1A). Bu başlangıç parametrelerinden, Gibbs serbest enerji değişimleri ve entropi değişimleri aşağıdaki ilişki kullanılarak belirlenir:
ΔG = ΔH-TΔS
Bu, ITC’nin bağlanma mekanizmalarını aydınlatmak için moleküler etkileşimin tam bir termodinamik profilini sunduğu anlamına gelir (Şekil 1B). Bir aptamer ile küçük moleküller için bağlanma afinitesini belirlemek, aptamer ve hedef arasındaki büyük ölçüde farklı boyutlar nedeniyle zordur. Bu arada, ITC, molekülleri etiketlemeden ve hareketsiz hale getirmeden hassas ölçüm sağlayabilir, bu da ölçüm sırasında aptamer ve hedefin doğal yapısını korumanın bir yolunu sağlar. Bahsedilen özelliklerle ITC, bir aptamer ve küçük hedefler arasındaki bağlanmanın karakterizasyonu için standart yöntem olarak kullanılabilir.
Gu grubu tarafından seçildikten sonra, bu aptamer elektrokimyasal aptamer bazlı biyosensörler, rekabetçi bir enzime bağlı aptamer testi ve tetrasiklin 8,9,10’un yüksek verimli tespitini sağlayabilen bir mikrotitre plakası dahil olmak üzere farklı platformlarla entegre edildi. Bununla birlikte, bağlayıcı özellikleri, uygun platform8’i seçmek için yeterince iyi aydınlatılmamıştır; aptamerin ITC kullanarak tetrasiklin ile bağlanmasını karakterize etmeye değer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yöntem TA Instruments’ın talimatına göre modifiye edilmiştir ve merkezimizde seçilen birçok aptamer ve hedefin bağlanma afinitesini ve termodinamiğini belirlemek için yeterlidir. Bu yordamın önemli adımları, arabelleğin ligandla eşleşen bir hedefe sahip olacak şekilde değiştirilmesini, numunelerin uygun parametrelerle çalıştırılmasını ve verileri analiz etmek için uygun bağlama uydurma modelinin bulunmasını içerir. Isı salınımının sürekli kaydedilmesi, tamponun uyumsuz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Aptagen LLC’nin Araştırma ve Geliştirme Fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2′,5′ RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
