Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rekonstituering av aktinbaserad rörlighet med kommersiellt tillgängliga proteiner

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64261
Automatic Translation
1, 1
1Laboratoire de physique de l’Ecole Normale Supérieure, ENS, Université PSL, CNRS, Sorbonne Université, Université Paris Cité

Summary

Detta protokoll beskriver hur man producerar aktinkometer på pärlornas ytor med kommersiellt tillgängliga proteiningredienser. Sådana system efterliknar de utskjutande strukturer som finns i celler och kan användas för att undersöka fysiologiska mekanismer för kraftproduktion på ett förenklat sätt.

Abstract

Många cellrörelser och formförändringar och vissa typer av intracellulär bakterie- och organellmotilitet drivs av biopolymeraktinet som bildar ett dynamiskt nätverk vid ytan av cellen, organellen eller bakterien. Den biokemiska och mekaniska grunden för kraftproduktion under denna process kan studeras genom att reproducera aktinbaserad rörelse på ett acellulärt sätt på inerta ytor såsom pärlor som funktionaliseras och inkuberas med en kontrollerad uppsättning komponenter. Under lämpliga förhållanden monteras ett elastiskt aktinnätverk vid pärlytan och bryts upp på grund av den spänning som genereras av nätverkstillväxt och bildar en "aktinkomet" som driver pärlan framåt. Sådana experiment kräver emellertid rening av en mängd olika aktinbindande proteiner, vilket ofta sätter dem utom räckhåll för icke-specialister. Denna artikel beskriver ett protokoll för reproducerbart erhållande av aktinkometer och rörlighet hos pärlor med hjälp av kommersiellt tillgängliga reagenser. Pärlbeläggning, pärlstorlek och motilitetsblandning kan ändras för att observera effekten på pärlhastighet, banor och andra parametrar. Denna analys kan användas för att testa de biokemiska aktiviteterna hos olika aktinbindande proteiner och för att utföra kvantitativa fysikaliska mätningar som belyser aktiva substansegenskaper hos aktinnätverk. Detta kommer att vara ett användbart verktyg för samhället, vilket möjliggör studier av in vitro aktinbaserad rörlighet utan expertkunskap inom aktinbindande proteinrening.

Introduction

Aktinpolymerisation i celler styrs rumsligt och tidsmässigt genom tät reglering av aktinfilamentkärnbildning nedströms cellsignalering1. Kärnbildning sker via bildandet av en aktin trimer, och sedan polymeriseras båda ändarna av det framväxande filamentet spontant, även om den ena änden är mer dynamisk (den taggiga änden) än den andra (den spetsiga änden)2. När kärnbildning och taggad ändpolymerisation riktas mot en yta producerar de tillräckligt med kraft (i pico-till-nano Newton-området) för att skjuta ut cellmembranet för rörelse och för att flytta mikronstora föremål inuti cellen med ATP-hydrolys som energikälla3. Några exempel är Listeria monocytogenes bakterier som använder aktinkometer för att sprida sig från cell till cell, och mitokondrier, där aktin kometbaserad rörelse är viktig för randomiserat arv under mitos 4,5. Aktinkometer på endosomer och andra intracellulära vesiklar är inblandade i lossning från donatormembran 6,7,8.

Med den metod som presenteras här kringgås signalaspekterna av cellulär aktinpolymerisation, och aktinpolymerisation produceras på mikrometriska polystyrenpärlor genom att belägga dem med aktivatorer av grenad aktinkärnbildning, speciellt den aktiva domänen för det humana WASP-proteinet, VCA (även kallat WA eller WCA)1. De belagda pärlorna inkuberas sedan i en blandning innehållande de ingredienser som är nödvändiga för aktinpolymerisation, inklusive huvudaktinpolymerisationsnukleatorn i celler, Arp2/3-komplexet, som aktiveras av VCA vid pärlytan för att bilda nya filament som grenar från sidorna av dotterfilament1. Actin polymeriserar initialt jämnt runt pärlan, men bryter sedan spontant symmetrin för att skapa en aktinkomet som skjuter pärlan framåt och därigenom återskapar cellliknande utskjutande nätverk och kometer på ett kontrollerat sätt. Liknande tillvägagångssätt med pärlor och andra belagda ytor har tidigare använts av oss och andra för att studera biokemi och biofysik för aktinpolymerisation 9,10,11,12, men omfattande expertis inom aktinbindande proteiner krävdes för dessa experiment. Protokollet som presenteras här beskriver hur man robust skapar aktinkometer och rörlighet helt med kommersiellt tillgängliga (eller snart tillgängliga) reagenser, vilket gör detta tillvägagångssätt tillgängligt för alla, inklusive i en pedagogisk miljö för undervisning av biofysiska begrepp. Viktiga funktioner inkluderar vikten av mild och pålitlig pipettering, användningen av profilinkomplex monomer som aktinkälla och väsentligheten i att använda en mycket aktiv Apr2/3-komplexaktivator som ett pärlbeläggningsreagens.

Protocol

1. Beredning av buffertar

OBS: Använd ultrarenH2Oför alla buffertar. Det behöver inte vara sterilt. Filtrera alla lösningar som beskrivs i steg 1.1–1.4 med ett sprutfilter på 0,2 μm, alikvotera i portioner om 500 μL–2 ml per rör beroende på användning och förvara vid -20 °C.

  1. Bered 10% BSA genom att väga 2 g BSA i ett 50 ml koniskt rör och fyll till 20 ml medH2O. Blanda tills BSA är upplöst (ca 30 min) och fyll sedan på volymen till 20 ml.
    OBS: Använd högkvalitativ BSA (se Materialförteckning). 10% BSA-lösningen används i både pärlberedning och motilitetsblandningen.
  2. För beredning av pärlor, förbered Xb-buffert (10 mM HEPES, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl2 och 0,1 mM CaCl2, pH 7,5) som en 10x lösning och späd före användning (100 μL 10x Xb stamlösning + 900 μLH2O). Bered Xb/1% BSA genom att blanda 100 μl 10x Xb stamlösning + 100 μl 10% BSA + 800 μLH2O.
  3. Förbered G-buffert (2 mM Tris, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mMDTT, 2 mM ATP), som är den buffert som används för att späda monomert aktin (G-aktin). Justera till pH 7, inte pH 8 som traditionellt används (se diskussion).
  4. Förbered motilitetsbufferten MB13 (10 mM HEPES, 1,5 mM ATP, 3 mM DTT, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1% BSA, pH 7,5). För vissa applikationer är 10x MB13 användbart. Förbered dock 10x MB13 utan BSA, eftersom det leder till problem under pH-justering. Tillsätt BSA från 10% stamlösning (beredd i steg 1.1) när du rekonstituerar 1x MB13 från 10x MB13.

2. Framställning av proteinlösningar

OBS: Använd ultrarenH2Oför alla resuspensioner. Det behöver inte vara sterilt. Hantera alla proteiner på is och alikvotera i förkylda rör. Manipulera försiktigt för att inte producera bubblor och virvla aldrig proteinlösningar. För att lager ska lagras vid -80 °C är blixtfrysning i flytande kväve inte nödvändig. Anpassa alikvotstorleken för att undvika mer än cirka fem frys-tina cykler, eftersom detta inte verkar påverka aktiviteten hos något av proteinerna. Arbetsalikvoter kan förvaras vid -20 °C i några veckor.

  1. Förbered G-aktin (kaninskelettmuskel) lösning enligt beskrivningen nedan.
    1. Pulscentrifugaktinpulver (se materialtabell) vid 4 °C för att samla upp det fasta ämnet i botten av röret.
    2. TillsättH2Oenligt tillverkarens anvisningar (1 mg protein i 100 μL kallt H2O-värde för omärkt aktin, 100 μg protein i 100 μl kalltH2O-märktaktin).
    3. Låt den sitta på is i minst 15 min. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner, låt det sitta på is minst 15 min till och blanda igen. Pulscentrifugera vid 4 °C för att samla upp lösningen i botten av röret och remixa.
    4. Förbered 10-50 μL alikvoter av omärkt aktin beroende på användning och 20 μL alikvoter av ATTO-märkt aktin. Förvara alikvoterna vid -80 °C.
    5. För att depolymerisera aktinoligomerer som bildas under frystorkning och frysning, späd en alikvot av resuspenderat aktin ~ 8 gånger i G-buffert spetsad med ytterligare ATP och DTT (till exempel till 20 μL resuspenderad aktinlösning från steg 2.1.4, tillsätt 134 μL G-buffert, 0,32 μL 0,2 mM ATP och 0,16 μL 1 M DTT). För fluorescerande märkning, tillsätt cirka 10% märkt aktin; tillsätt till exempel 5 μL ATTO-märkt aktin till 40 μL utspätt omärkt aktin. Låt den depolymeriseras på is med tillfällig blandning (pipettering) minst några dagar till en vecka innan du mäter proteinkoncentrationen med Bradford-analys enligt beskrivningen i steg 3.
      OBS: Förvara utspätt omärkt och fluorescerande aktin på is i ett kylrum eller kylskåp; Frys aldrig eller låt värma. Preparatet kommer att fortsätta depolymerisera över tid, och när det hanteras korrekt kan det användas i minst 6 månader.
  2. Återsuspendera Arp2/3-komplexet (svinhjärna) (se materialförteckningen) enligt tillverkarens anvisningar (20 μg protein i 20 μl kallt H2O), med sekvensen av pulscentrifugering, blandning etc. på is enligt beskrivningen för aktin i steg 2.1. Kombinera proteinlösningarna från att återsuspendera två rör pulver för att få ett större lager för reproducerbara experiment. Bered 2 μl alikvoter och förvara vid -80 °C.
  3. Återsuspendera profilin (humant rekombinant) (se materialförteckning) i en 4x högre koncentration än vad som anges i tillverkarens anvisningar (100 μg protein i 25 μL kallt H2O), med sekvensen av pulscentrifugering, blandning etc. på is som för aktin i steg 2.1. Kombinera proteinlösningarna från att återsuspendera två rör pulver innan du bestämmer proteinkoncentrationen för att få ett större lager för reproducerbara experiment.
    OBS: Förvara på is i ett kallt rum eller kylskåp; Frys aldrig eller låt värma. När det hanteras korrekt är resuspenderad profilin bra i minst 6 månader till 1 år.
  4. Återsuspendera cappingprotein (α1β2, humant rekombinant) (se materialförteckning) enligt tillverkarens anvisningar (50 μg protein i 50 μl kallt H2O), med sekvensen av pulscentrifugering, blandning etc. på is enligt beskrivningen för aktin i steg 2.1. Kyl 50 μl glycerol på is och tillsätt 50 μl återsuspenderat kapslingsprotein till det. blanda försiktigt. Förvaras vid -20 °C.
    OBS: Lösningen fryser inte och aktiviteten är robust, så lösningen kan förvaras som en enda alikvot i månader, eller till och med år, om den hanteras försiktigt. Musrekombinant kapslingsprotein, det som tidigare använts mest i in vitro-experiment 13, kommer snart att vara kommersiellt tillgängligt.
  5. Återsuspendera gelsolin (humant rekombinant, His-märkt) (se materialförteckning) enligt tillverkarens anvisningar (20 μg protein i 20 μL kallt H2O), med sekvensen av pulscentrifugering, blandning etc. på is enligt beskrivningen för aktin i steg 2.1. Cirka 2 μl gelsolin används per dag av experiment; Bered därför stora alikvoter (5-10 μl) och förvara vid -80 °C.
    OBS: Protokollet med gelsolin tillhandahålls som ett alternativ. Användning av cappingprotein i stället för gelsolin rekommenderas, antingen köpt eller renat som i13.
  6. Återsuspendera VCA (human WASP-VCA, GST-märkt) (se materialförteckning) vid 2x högre koncentration än vad som anges i tillverkarens instruktioner (500 μg protein i 250 μL kallt H 2 O), med sekvensen av pulscentrifugering, blandning etc. på is som för aktin i steg2.1. Gör alikvoter på 10 μl och förvara vid -80 °C.
    OBS: När SpVCA (human pVCA, streptavidin och His-taggad) kommersialiseras eller om proteinrening14 är möjlig rekommenderas användning av SpVCA istället för VCA. VCA ger inte reproducerbart kometer under de förhållanden som beskrivs här.

3. Mätning av proteinkoncentrationer

  1. Konstruera en Bradford-standardkurva gjord av två överlappande seriella utspädningar av BSA.
    OBS: Standardkurvan behöver bara konstrueras varannan månad (eller ännu mindre ofta) så länge spektrofotometern inte ändras.
    1. På rad 1 i ett mikrorörsställ, placera rör för BSA-utspädningsserie #1: fyra 2 ml rör följt av fyra 1,5 ml rör. På rad 3 i racket, placera rör för BSA-utspädningsserie #2 som för serie #1. På rad 5 i racket, placera ett 2 ml rör för varje prov som ska mätas tillsammans med två 1,5 ml rör. Lägg till ett enda 1,5 ml rör i rad 5 för ämnet.
    2. Mät upp Bradford Reagens (se materialtabell) i 1,5 ml rör.
      1. Fyll ett 15 ml koniskt rör till toppen med Bradford Reagens för enklare pipettering (överskott kommer att returneras till lagerflaskan i kylen) på is. Ta upp 200 μL Bradford Reagens och mata ut det tillbaka i det koniska röret för att blöta pipettspetsen. Eftersom lösningen är viskös, pipettera långsamt så att lösningen kan komma in och lämna spetsen helt utan att göra bubblor.
      2. Med den "förvåta" spetsen pipetterar du långsamt 200 μl Bradford-reagens i vart och ett av 1,5 ml rören i stället (fyra för varje BSA-utspädning, ett för blindprovet och två för varje prov som ska mätas). Gör detta först för att låta Bradford-reagenset värmas ordentligt till rumstemperatur innan det blandas med proteinlösningar. Sätt tillbaka det återstående innehållet i det 15 ml koniska röret till flaskan.
    3. Mät utH2Oi 2 ml rören. På rad 1 i racket tillsätter du 1 990 μLH2Otill det första röret och 900 μL till de tre andra rören. För rad 3, tillsätt 1 992,5 μl till det första röret och 900 μl till de tre andra rören. Tillsätt 2 000 μlH2Otill vart och ett av provrören på rad 5.
      OBS: För alla volymer som är större än 1 000 μl, använd en pipett på 1 000 μl, men administrera hela mängden genom pipettering två gånger. Det är viktigt att göra allt klart innan du börjar de efterföljande stegen för att undvika att proteiner är mycket utspädda iH2Ounder långa perioder.
    4. För att bereda BSA-utspädningsserie #1, blanda 10 μl kalibrerad 2 mg/ml BSA (se materialförteckning) i röret med 1 990 μl H2O för att göra en lösning på 10 μg/ml. Gör därför tre seriella utspädningar (5 μg/ml, 2,5 μg/ml och 1,25 μg/ml BSA) genom att överföra 900 μl av varje lösning till nästa rör (innehållande 900 μLH2O).
    5. För att bereda BSA-utspädningsserie #2, blanda 7,5 μl kalibrerad 2 mg/ml BSA i röret med 1 992,5 μL H2O för att göra en 7,5 μg/ml lösning. Gör från detta tre seriella utspädningar (3,75 μg / ml, 1,875 μg / ml och 0,9375 μg / ml BSA) genom att överföra 900 μL av varje lösning till nästa rör (innehållande 900 μLH2O).
    6. Blanda och läs absorbans för att generera standardkurvan. Tillsätt 800 μLH2Otill Bradford-reagensröret för ämnet och starta timern. Så effektivt som möjligt utan att göra bubblor, blanda 800 μL av varje BSA-standard med 200 μL Bradford-reagens i de beredda rören. När alla standarder har blandats med Bradford-reagens (< 5 min), häll varje standard i en engångskyvett och läs av absorbansen vid 600 nm i spektrofotometern efter att maskinen har tömts.
      OBS: Samma kyvett kan användas för att läsa hela serien om den minst koncentrerade standarden läses först och kyvetten är väl tömd mellan läsningarna. Gör om standardkurvan tills den linjära passningen har ett R-värde på minst 0,99. Först efter att pipettering och mild blandning har behärskats, fortsätt att läsa prover.
  2. Mät koncentrationer av aktin och aktinbindande proteiner
    1. Blanda försiktigt i 2 ml rör som innehåller 2 000 μl H2O (beredda i steg 3.1.3): 2 μL vardera avArp2/3-komplex och profilin, 4 μL märkt G-aktin, 5 μl vardera gelsolin och VCA och 8 μL kapslingsprotein (humant rekombinant). Ta omedelbart 800 μl av lösningen och blanda med det redan beredda Bradford-reagenset och upprepa sedan för att ha två avläsningar inom 5%-10% av varandra för varje prov. En större skillnad indikerar ett problem med resuspension eller hantering. Läs inom några minuter efter blandning med Bradford-reagens.
      Anmärkning: Om en standardkurva från en annan dag används behöver endast det tomma ämnet från steg 3.1.6 förberedas, utöver proverna.
  3. Beräkna koncentrationerna av aktin och aktinbindande proteiner med hjälp av standardkurvan och utspädningsfaktorn. Gör om mätningen för varje ny resuspension. Molekylvikter för att omvandla mg / ml-avläsningar erhållna via Bradford-analys till μM är: aktin 43 kD, Arp2/3-komplex 224 kD, profilin 15 kD, gelsolin 95 kD, täckprotein 68 kD (humant rekombinant) eller 63,5 kD (musrekombinant), VCA 43 kD och SpVCA 54 kD (monomermolekylvikt).

4. Beläggning av pärlor

  1. Förkyl centrifugen till 4 °C och ställ in det omrörande torra blocket (se materialtabellen) på 18 °C.
  2. Tvätta pärlorna: pipettera 50 μL Xb-buffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 9 μl pärlsuspension med en diameter på 4,5 μm eller 2 μl en pärlsuspension med en diameter på 1 μm (2,5 % w/v suspension) (se materialförteckning). Blanda noggrant och centrifugera proverna vid 20 000 x g i 10 min vid 4 °C.
    OBS: Total pärlyta för båda pärlstorlekarna är 3 cm2:
    Equation 1
    härledd genom att beräkna antalet pärlor och sedan deras totala yta med hjälp av klassiska ekvationer för sfärernas volym och ytarea. Andra storlekar på pärlor kan användas om mängderna justeras för att hålla den totala ytan konstant vid 3 cm2.
  3. Täck pärlorna: ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pärlorna och återsuspendera pärlpelleten i 40 μL 2 μM SpVCA (eller 7 μM VCA) i Xb-buffert genom försiktig pipettering. Agitera vid 18 °C, 1 000 rpm i 20 min.
  4. Tvätta belagda pärlor: Centrifugera blandningen (20 000 x g i 10 min vid 4 °C) och avlägsna supernatanten försiktigt. Återsuspendera pärlorna i 50 μl kall Xb/1% BSA och centrifugera vid 20 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och upprepa tvättsteget 1x.
  5. Återsuspendera den belagda pärlpelleten från steg 4.4 i 120 μL kall Xb/1% BSA för båda storlekarna på pärlorna så att mängden pärlyta/μl pärllösning är densamma. Förvara på is i kylskåp eller kylrum. Belagda pärlor fortsätter att fungera normalt i minst flera veckor.

5. Förbereda motilitetsblandningen och bilderna för observation

OBS: Den totala volymen för motilitetsblandningen är 8,4 μL för att möjliggöra cirka 25 μm spelrum mellan objektsglaset och täckglaset 18 mm x 18 mm så att pärlor av alla storlekar (upp till 10 μm diameter) inte pressas. Den grundläggande motilitetsblandningen är ungefär 5 μM G-aktin (10% märkt fluorescerande aktin) med 5 μM profilin, 50 nM Arp2/3-komplex och 25 nM täckprotein (eller 240 nM gelsolin).

  1. Förbered motilitetsreaktionsblandningen. Exakta mängder aktin (och därmed profilin) beror på koncentrationen beräknad i steg 3.3, men en representativ reaktion är som följer. Blanda på is, i denna ordning: 3,2 μL MB13, 1,5 μL profilin vid 30 μM utspätt i MB13, 1 μL täckprotein vid 0,21 μM utspätt i MB13 eller gelsolin utspätt till 2 μM i MB13, 1 μL Arp2/3-komplex vid 0,47 μM utspätt i MB13, 0,2 μL pärlsuspension (virvel strax före användning), och 1,5 μL aktin vid 30 μM i G-buffert. Blanda väl men snabbt och starta timern.
  2. Upptäck hela motilitetsreaktionsblandningen på en bild. Täck med en 18 mm x 18 mm täckglas och täta täckglaset med smält VALAP med en liten pensel. VALAP är en blandning av lanolin, paraffin och vaselin (se materialtabell) 1:1:1 i vikt, smält och omrörd tillsammans.

6. Mikroskopi observation

  1. Observera motilitetsreaktioner omedelbart med hjälp av ett 100x-mål på antingen ett upprätt eller ett inverterat mikroskop (se materialtabell), utrustad med faskontrast och / eller epifluorescensmikroskopi (GFP-kub, se materialtabell). Observationerna görs vid rumstemperatur (23-25 °C).
    1. För att få genomsnittliga förskjutningshastigheter för en hel population av pärlor, registrera faskontrast eller fluorescerande stillbilder över tid genom att skanna hela bilden. Mät kometlängden för hand och plotta kontra tid. Lutningen på den linjära passformen är den genomsnittliga tillväxthastigheten.
    2. För att utvärdera hastigheten på enskilda pärlor, samla time-lapse-filmer i faskontrastmikroskopi. Beroende på pärlhastigheten och den upplösning som krävs, ta ramar var 1-10: e s. Använd spårningsverktyget för alla bildbehandlingsprogram för att få pärlhastigheter och banor.

Representative Results

En av de viktigaste aspekterna av att reproducerbart skapa aktinkometer på pärlor är mild och exakt pipettering av känsliga aktinbindande proteiner. Att generera en Bradford-standardkurva är ett bra sätt att utvärdera pipetteringsförmåga. Figur 1A,B visar rören för standardkurvan och ett exempel på hur de två seriella utspädningarna av BSA ser ut när de väl blandats med Bradford-reagens. Notera den graderade blå nyansen (högre proteinkoncentration ger en blåare lösning). När de läses i spektrofotometern och plottas ger dessa lösningar en standardkurva som visas i figur 1C. För att öva noggrann pipettering bör analysen upprepas tills den linjära korrelationsfaktorn är 0, 999, som visas.

När koncentrationerna av kommersiella återsuspenderade proteiner har utvärderats noggrant via Bradford-analysen bereds och blandas belagda pärlor och motilitetsblandning. Figur 2A visar representativa bilder av de olika stadierna av kometbildning: aktinmoln bildas inom några minuter efter blandning av SpVCA-belagda pärlor och motilitetsmedium; Molnpolarisering sker vid ~5 min och kometproduktion vid 15-20 min. Aktinkometerna, synliga med både epifluorescens och faskontrastmikroskopi (figur 2A), fortsätter att förlängas i många timmar, men en jämn hastighet bibehålls inte så pärlmotiliteten utvärderas normalt inom 1 h. Å andra sidan tar det 30 minuter med VCA-belagda pärlor för att få ljusa aktinmoln (figur 2B), och inga kometer bildas, även om symmetrin börjar bryta vid 1-2 h (pil i figur 2B) och moln visar polarisering efter inkubation över natten.

Figur 3 visar ett exempel på utvärdering av pärlhastighet i närvaro av kapslingsprotein. Eftersom alla pärlor bryter symmetrin ungefär samtidigt utförs "pseudo-time-lapse"-inspelningar där bilden skannas och bilder av hela populationen av kometer tas över tiden (figur 3A). Kometer depolymeriserar inte; Därför kan ökningen av kometlängder mätt över tid användas för att beräkna förskjutningshastighet (figur 3B). Gelsolin kan användas i stället för kapslingsprotein för kometbildning om 10x mer gelsolin tillsätts för att kompensera för dess reducerade kapslingsaktivitet. Kometer som bildas i närvaro av gelsolin är kvalitativt desamma och rör sig med ungefär samma hastigheter som pärlor med täckande protein (Figur 3C). Kapslingsaktivitet är nyckeln till att koncentrera polymerisationen vid pärlans yta, och när varken kapslingsprotein eller gelsolin ingår i motilitetsblandningen polariseras aktinmoln aldrig för att bilda kometer, även om ljusa aktinmoln bildas runt pärlorna (figur 3D). Kometer på pärlor kan användas för att mäta aktinbaserad kraftproduktion i olika biokemiska sammanhang genom att ändra motilitetsblandningen och observera resultatet på motilitet med hjälp av olika mikromanipuleringstekniker, till exempel15.

Figure 1
Figur 1: Bradfords standardkurva. (A) Bild av hur man ställer in rören för att göra Bradfords standardkurva. Provrör visas inte. (B) Bild av de två överlappande BSA-serieutspädningarna som en gång blandats med Bradford-reagens. C) Absorbanserna vid 600 nm av de lösningar som visas i (B) mäts i spektrofotometern och plottas som en funktion av proteinkoncentrationerna i BSA-lösningarna. Den linjära passformen används för att beräkna provkoncentrationen. Korrelationsfaktorn, R, för den linjära passformen är 0,999. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kometbildning på SpVCA-belagda pärlor i motsats till VCA-belagda pärlor. (A) Representativa SpVCA-belagda pärlor (olika pärlor i varje bild) som visas över tiden. Tid från blandningstillfället anges. Aktinmoln bildas omedelbart, och molnpolarisering ger kometer, som fortsätter att förlängas i timmar. (B) Representativa VCA-belagda pärlor (olika pärlor i varje bild) som visas över tiden. Mer än 1 h är nödvändigt för att se början på aktinmolnpolarisering (pil) och även långa inkubationer producerar inte kometer. Alla bilder är av pärlor med en diameter på 4,5 μm, epifluorescensavbildning av fluorescerande aktin parat med faskontrastvisualisering för 15 och 20 minuters tidspunkter i (A), skalstänger = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Kometer och pärlhastighetsanalys . (A) och (C) I närvaro av antingen capping protein (CP) eller gelsolin polariserar aktinmoln för att bilda kometer under de första 20 minuterna av reaktionen, och kometer förlängs över tiden. Tid från blandning anges för varje bild; varje bild är en annan pärla. Det finns en viss variation mellan pärlor och beredning, men i genomsnitt rör sig pärlor med mikron / submikron per min hastigheter (0,2-1 μm / min) under de standardförhållanden som beskrivs här. (B) Representativ graf som visar utvärdering av kometlängd (hela populationen av pärlor) över tid. Lutningen på den linjära korrelationen motsvarar den genomsnittliga förskjutningshastigheten, i detta fall 0,24 μm/min. (D) I avsaknad av kappaktivitet (inget kapslingsprotein eller gelsolin) bildas aktinmoln runt pärlor, men kometer bildas inte. Alla bilder är av pärlor med en diameter på 4,5 μm, epifluorescensavbildning av fluorescerande aktin, skalstänger = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Protokollet som beskrivs här beskriver hur man får aktinnätverkstillväxt på pärlytor, kometbildning och pärlmotilitet med hjälp av kommersiellt tillgängliga proteiner. Ibland observeras emellertid inte kometer reproducerbart eller är inhomogena mellan bilden och täckglaset. Följande diskussion betonar några viktiga punkter i protokollet och föreslår några parametrar som kan justeras. En faktor att tänka på är att kometbildning och pärlhastighet påverkas av temperaturen, med temperaturer mycket över 25 °C eller mycket under 23 °C som påverkar kometbildningen negativt och ger irreproducerbara data. Användning av ett temperaturkontrollerat mikroskop eller ett mikroskop i ett klimatkontrollerat rum rekommenderas starkt. Även om fluorescerande märkt aktin ofta ingår i motilitetsblandningen för att observera kometer genom fluorescensmikroskopi, när kometer är mer än en pärldiameter i längd, är de också synliga med faskontrastmikroskopi som ett mörkt smet bredvid pärlan. Faskontrastvisualisering är mer lämplig för time-lapse-avbildning eftersom viss fototoxicitet är associerad med fluorescensavbildning även via snurrande skiva. Eftersom pärlor sätter sig med tiden ger ett inverterat mikroskop mindre horisontell pärldrift än ett upprätt och är mer lämpligt för filmer. Användningen av smält VALAP för att täta objektsglas är viktigt eftersom ämnen som nagellack stör kometbildningen. Stora mängder VALAP kan tillverkas i en bägare och sedan skopas ut för att fylla på mindre bägare som är mer mottagliga för snabb smältning. VALAP är bra i flera år vid rumstemperatur.

En annan viktig teknisk aspekt är noggrann beredning av buffert- och rörlighetsblandningar. Försiktighet bör iakttas vid beredning av MB13, särskilt vid pH-justeringssteget. pH-värdet i MB13 bör justeras snabbt till neutralt med NaOH för att undvika ATP-hydrolys, men inte för snabbt eftersom EGTA solubiliseras när pH-värdet närmar sig neutralt. EGTA är en viktig ingrediens eftersom den komplexiserar kalciumet bundet till aktin, vilket ger i motilitetsblandningen den mer aktiva magnesiumformen16. MB13 beredd för snabbt eller för långsamt ger suboptimal kometbildning eller till och med ingen alls. En ytterligare viktig punkt är att hålla noggrann koll på KCl-koncentrationen i motilitetsmixen när man leker med förhållanden. Till exempel, vid användning av 1x MB13 i reaktionsblandningen och utspädning av profilin, kapslingsprotein och Arp2/3-komplexet i MB13, är den slutliga KCl-koncentrationen i motilitetsreaktionen ca 40-50 mM på grund av utspädning med G-buffert. Denna koncentration ger de bästa resultaten i kometanalysen, och mer än 60 mM KCl minskar Arp2/3 komplex kärnbildningsaktivitet.

På proteinsidan av saker är en kritisk teknisk aspekt av att erhålla aktinkometer korrekt hantering av kommersiella aktinbindande proteiner, i synnerhet exakt pipettering av mikrolitermängder. Linjäriteten i Bradfords standardkurva är ett bra test av pipettering och kurvan kan sedan användas för rutinmässiga mätningar av proteinkoncentrationer. När man använder återsuspenderade kommersiella proteiner för kometproceduren är det viktigt att alltid verifiera proteinkoncentrationer, eftersom batchvariation och användarfel under resuspension kan leda till skillnader mellan verkliga och förväntade koncentrationer. Ibland kan små skillnader i proteinkoncentrationer leda till fullständig frånvaro av kometer.

En annan viktig aspekt av metoden som presenteras här är användningen av profilinkomplexat G-aktin som bränsle för polymerisation. Historiskt sett använde in vitro-system förpolymeriserat trådformigt aktin (F-aktin) som aktinkälla: depolymerisation i bulkmatad polymerisation på ytan10,17. Detta hade fördelen att kontrollera G-aktinnivåer, men lade till ett lager av komplexitet som krävde ytterligare komponenter för att katalysera depolymerisation. Eftersom omsättningen av aktinnätverket inte är nödvändig för kraftproduktion och rörlighet, som drivs av kärnbildning och polymerisation vid bönans yta, medan aktindepolymerisationsfaktorer som ADF/cofilin verkar på de åldrade nätverken långt från ytan18, görs nu den mesta in vitro-rekonstitueringen av aktinbaserad rörlighet utan omsättning för enkelhetens skull. Det finns emellertid vissa nackdelar med att använda G-aktin. För det första, när man använder kommersiellt aktin, som har lyofiliserats, är oligomerer närvarande. Depolymerisationsstegen som beskrivs här är mycket viktiga för att erhålla reproducerbara resultat. I synnerhet, även om G-buffert traditionellt justeras till pH 8, verkar lägre pH (pH 7, till exempel) fungera bättre i de analyser som beskrivs i denna artikel, möjligen för att lågt pH förbättrar depolymerisation19. En annan nackdel med att använda G-aktin är att en gång placerad i saltförhållanden som är tillåtna för polymerisation uppträder spontan kärnbildning och F-aktin bildas i bulk såväl som på pärlytan. Komplexbildning av G-aktin med profilin undertrycker spontan kärnbildning i bulk och spetsig ändpolymerisation, varigenom både kärnbildning och taggad ändpolymerisation fokuseras vid ytan20. Profilin-G-aktin är fysiologiskt relevant, eftersom mycket av aktinet i cellen är närvarande i denna form21. Här används ett 1: 1-förhållande mellan profilin: aktin; emellertid hämmar högre förhållanden (till exempel 3: 1) mer noggrant polymerisation i bulk, även om högre förhållanden också hämmar Arp2 / 3-komplexet och taggad ändförlängning till viss del22,23.

Kapslingsaktivitet är också nyckeln till kometbildning eftersom det säkerställer införande av nytt aktin vid ytan via kärnbildningscykler av ytaktiverat Arp2/3-komplex24,25. Utan capping bryter aktinmoln inte symmetri för att bilda kometer eftersom polymerisation vid ytan inte bygger upp tillräckligt med spänning för att bryta upp molnet26. Tidigare har vi använt hemrenat rekombinant muskapslingsprotein13, men tester som utförts för denna artikel indikerar att kommersiellt tillgängligt rekombinant humant kapslingsprotein är lika effektivt, liksom kommersiellt tillgängligt gelsolin, även om 10x mer gelsolin måste användas, och för vissa applikationer kanske det inte är lämpligt eftersom det har aktinavskiljningsaktivitet samt tak27.

Slutligen ligger robustheten hos denna metod i användningen av en mycket aktiv Arp2/3-komplexaktivator, streptavidin-pVCA (SpVCA)28. SpVCA inkluderar WASP:s (p-domänen) profilin-G-aktinbindningsdomän utöver den komplexa bindningsdomänen Arp2/3 eftersom detta visar sig vara mest effektivt i profilin-G-aktinförhållanden29. Ännu viktigare är att användningen av streptavidin-taggen, som ursprungligen introducerades för att möjliggöra ytfunktionalisering via biotin-streptavidinlänken, har den ytterligare effekten av att öka Arp2/3-komplexaktiveringen, förmodligen på grund av det faktum att streptavidin är en tetramer och därmed kluster aktivatorn, känd för att öka Arp2/3-komplexaktiviteten30 . Kommersiellt producerad SpVCA är för närvarande under utveckling och kommer snart att finnas att köpa. Det bör vidare noteras att även om 40 μL av 2 μM SpVCA rutinmässigt används för att belägga 3 cm2 pärlyta, fungerar också andra beläggningskoncentrationer (högre och lägre), och att leka med dessa förhållanden ger olika komettillväxthastigheter och morfologier. När kometer inte bildas eller kometstorleken inte är homogen på objektsglaset bör olika beläggningsförhållanden testas, liksom olika KCl- och profilinkoncentrationer i motilitetsblandningen. Koncentrationerna av aktin, Arp2/3-komplex och kapslingsprotein i motilitetsblandningen kan också ändras för att optimera kometbildning, men i våra händer ger förändring av dessa proportioner ofta förvirrande resultat.

Sammanfattningsvis producerar de metoder som beskrivs här aktinmontering på pärlytor och rörlighet, men alla ytor som kan funktionaliseras med SpVCA kan användas. I de fall adsorption som beskrivs här inte fungerar kan streptavidindelen användas för att fästa SpVCA på ytan av intresse efter biotinylering. De sålunda bildade aktinstrukturerna, kometer eller på annat sätt, kan användas för att testa olika biokemiska och biofysiska aspekter av aktinnätverk och är särskilt lämpliga för fysiska manipulationer med mikropipetter, optisk pincett och laserablationer 15,26,31,32. Förutom dess användningsområden för forskarsamhället är det tillvägagångssätt som beskrivs här lämpligt som ett undervisningsverktyg för grundutbildningsstudenter i biofysik för att studera aktiva materiabegrepp som symmetribrytning och självorganisation.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter med innehållet i denna artikel.

Acknowledgments

Vi erkänner uppriktigt medlemmarna i vårt nya hem på LPENS för deras varma välkomnande, och i synnerhet ABCDJ-teamet för all deras hjälp och stöd. JP erkänner ekonomiskt stöd från Foundation ARC (Grant PJA 20191209604), och CS erkänner ekonomiskt stöd från Human Frontiers Science Program Organization (Grant RGP0026/2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate  Invitrogen (ThermoFisher Scientific) A12373 (recently discontinued) This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol.
Actin, rabbit muscle, ATTO-488 Hypermol 8153
Actin, rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99
Arp2/3 complex Cytoskeleton RP01P
ATP Sigma A7699
BioSpectrometer, basic Eppendorf 035739
Bradford Reagent Bio-Rad 500-0006
BSA, high quality Sigma A3059
BSA standard 2 mg/mL (Pierce) Thermo Scientific 23209
Capping protein (a1b2, mouse recombinant) Home-purified (Reference 13) This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
Capping protein (a1b2, human recombinant) Hypermol 8322
Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2 Olympus discontinued Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used.
Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated) Eppendorf 035963
** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL Eppendorf 035969
Gelsolin (human recombinant, His-tagged) Cytoskeleton HPG6
Lanolin Sigma 49909
Microcentrifuge 5427R + rotor Eppendorf 934126
Microscope, upright: BX51 Olympus discontinued Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Microscope, inverted: IX70 Olympus discontinued Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Paraffin Sigma 76244
Petroleum jelly: Vaseline Sigma 16415
Pipettes Research Plus Eppendorf Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example).
**10 µL 933954
**2.5 µL 933953 These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended.
Polystyrene carboxylate beads Polysciences
**approx. 1 µm diameter 08226
**approx. 4.5 µm diameter 17140-5
Profilin 1 (human recombinant, untagged) Cytoskeleton PR02
SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag) Home-purified (Reference 14) This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged) Cytoskeleton VCG03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campellone, K. G., Welch, M. D. A nucleator arms race: cellular control of actin assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 237-251 (2010).
  2. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
  3. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture and mechanics in cell motility. Physiological Reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  4. Tilney, L. G., Tilney, M. S. The wily ways of a parasite: induction of actin assembly by Listeria. Trends in Microbiology. 1 (1), 25-31 (1993).
  5. Moore, A. S., et al. Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis. Nature. 591 (7851), 659-664 (2021).
  6. Taunton, J., et al. Actin-dependent propulsion of endosomes and lysosomes by recruitment of N-WASP. Journal of Cell Biology. 148 (3), 519-530 (2000).
  7. Velarde, N., Gunsalus, K. C., Piano, F. Diverse roles of actin in C. elegans early embryogenesis. BMC Developmental Biology. 7, 142 (2007).
  8. Merrifield, C. J., et al. Endocytic vesicles move at the tips of actin tails in cultured mast cells. Nature Cell Biology. 1 (1), 72-74 (1999).
  9. Samarin, S., et al. How VASP enhances actin-based motility. Journal of Cell Biology. 163 (1), 131-142 (2003).
  10. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  11. Boujemaa-Paterski, R., et al. Network heterogeneity regulates steering in actin-based motility. Nature Communications. 8 (1), 655 (2017).
  12. Akin, O., Mullins, R. D. Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex. Cell. 133 (5), 841-851 (2008).
  13. Palmgren, S., Ojala, P. J., Wear, M. A., Cooper, J. A., Lappalainen, P. Interactions with PIP2, ADP-actin monomers, and capping protein regulate the activity and localization of yeast twinfilin. Journal of Cell Biology. 155 (2), 251-260 (2001).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 368 (1629), 20130005 (2013).
  15. Marcy, Y., Prost, J., Carlier, M. -F., Sykes, C. Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 5992-5997 (2004).
  16. Carlier, M. -F. Actin: protein structure and filament dynamics. Journal of Biological Chemistry. 266 (1), 1-4 (1991).
  17. Loisel, T. P., Boujemaa, R., Pantaloni, D., Carlier, M. F. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 401 (6753), 613-616 (1999).
  18. Reymann, A. -C., et al. Turnover of branched actin filament networks by stochastic fragmentation with ADF/cofilin. Molecular Biology of the Cell. 22 (14), 2541-2550 (2011).
  19. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Quantitative variations with pH of Actin Depolymerizing Factor/Cofilin's multiple actions on actin filaments. Biochemistry. 58 (1), 40-47 (2019).
  20. Plastino, J., Blanchoin, L. Dynamic stability of the actin ecosystem. Journal of Cell Science. 132 (4), 219832 (2019).
  21. Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
  22. Suarez, C., et al. Profilin regulates F-actin network homeostasis by favoring formin over Arp2/3 complex. Developmental Cell. 32 (1), 43-53 (2015).
  23. Courtemanche, N., Pollard, T. D. Interaction of profilin with the barbed end of actin filaments. Biochemistry. 52 (37), 6456-6466 (2013).
  24. Achard, V., et al. A "primer"-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility. Current Biology. 20 (5), 423-428 (2010).
  25. Sykes, C., Plastino, J. Actin filaments up against a wall. Nature. 464 (7287), 365-366 (2010).
  26. vander Gucht, J., Paluch, E., Plastino, J., Sykes, C. Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7847-7852 (2005).
  27. McGough, A. M., Staiger, C. J., Min, J. -K., Simonetti, K. D. The gelsolin family of actin regulatory proteins: modular structures, versatile functions. FEBS Letters. 552 (2-3), 75-81 (2003).
  28. Abou-Ghali, M., et al. Capping protein is not necessary for polarized actin network growth and actin based motility. Journal of Biological Chemistry. 295, 15366-15375 (2020).
  29. Yarar, D., D'Alessio, J. A., Jeng, R. L., Welch, M. D. Motility determinants in WASP family proteins. Molecular Biology of the Cell. 13 (11), 4045-4059 (2002).
  30. Padrick, S. B., et al. Hierarchical regulation of WASP/WAVE proteins. Molecular Cell. 32 (3), 426-438 (2008).
  31. Bussonier, M., et al. Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex. Biophysical Journal. 107 (4), 854-862 (2014).
  32. Paluch, E., vander Gucht, J., Joanny, J. -F., Sykes, C. Deformations in actin comets from rocketing beads. Biophysical Journal. 91 (8), 3113-3122 (2006).

Tags

Bioengineering utgåva 188
Rekonstituering av aktinbaserad rörlighet med kommersiellt tillgängliga proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sykes, C., Plastino, J.… More

Sykes, C., Plastino, J. Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64261, doi:10.3791/64261 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter