Salmonella invaderer og replikerer inne i tarmepitelceller både i Salmonella-spesifikke vakuoler og fri i cytosolen (hyperreplikasjon). En fluorescensmikroskopibasert protokoll med høy gjennomstrømning er beskrevet her for å kvantifisere de intracellulære fenotypene av Salmonella ved to komplementære bildeanalyser gjennom ImageJ, og nå encellet oppløsning og skåring.
Salmonella er et enterisk patogen som er i stand til å invadere tarmepitelet og replikere i enterocytter, både inne i Salmonella-spesifikke vakuoler og fri i cytosolen (cytosolisk hyperreplikasjon). Disse forskjellige fenotypene av intracellulær replikasjonsdrift til forskjellige patogeneseveier, dvs. cytosolisk hyperreplikasjon induserer inflammatorisk celledød og ekstrudering i tarmlumen, mens vacuolar replikasjon fører til transepitelpenetrasjon og systemisk spredning. Det ble gjort en betydelig innsats for å lage mikroskopiverktøy for å studere oppførselen til Salmonella inne i invaderte celler, for eksempel pCHAR-Duo fluorescensreporterplasmid som tillater diskriminering mellom vakuolære og cytosoliske bakterier ved differensialuttrykk av mCherry og GFP. Imidlertid blir intracellulære fenotyper ofte manuelt scoret, en tidkrevende prosedyre som begrenser analysen til et lite antall prøver og celler. For å overvinne disse begrensningene ble to komplementære og automatiserte bildeanalyser utviklet ved hjelp av ImageJ, en fritt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare. I high-throughput-protokollen ble epitelceller infisert med Salmonella som bærer pCHAR-Duo ved bruk av 96-brønnsplater. Avbildning ble utført ved hjelp av et automatisert fluorescensmikroskop. Deretter ble to bildeanalysemetoder brukt for å måle den intracellulære oppførselen til Salmonella på forskjellige detaljnivåer. Den første metoden måler den totale intracellulære bakteriebelastningen og omfanget av cytosolisk hyperreplikasjon. Det er raskt og tillater scoring av et høyt antall celler og prøver, noe som gjør det egnet for høy gjennomstrømningsanalyser som screeningeksperimenter. Den andre metoden utfører enkeltcelleanalyse for å bestemme prosentandelen infiserte celler, den gjennomsnittlige vakuolære belastningen av Salmonella og den cytosoliske hyperreplikasjonshastigheten som gir større detaljer om Salmonella-oppførsel inne i epitelceller. Protokollene kan utføres av spesialdesignede ImageJ-skript for automatisk å kjøre batchanalyser av de viktigste trinnene i Salmonella-enterocyttinteraksjon.
Salmonella er det hyppigst rapporterte bakterielle middelet som forårsaker utbrudd av matbåren sykdom i EU1. Den primære patologiske manifestasjonen av Salmonella-infeksjon er enteritt, som er resultatet av patogenadferden i tarmen etter inntak og den påfølgende lokale inflammatoriske responsen2. Salmonella kan imidlertid også spre seg til ekstra-intestinale steder og forårsake systemisk infeksjon, spesielt hos immunkompromitterte individer. Typen interaksjon mellom Salmonella og tarmepitelet betinger utfallet av infeksjonen. En gang i tarmlumen invaderer og replikerer Salmonella inne i tarmepitelceller. På intracellulært nivå kan Salmonella presentere to forskjellige replikasjonsfenotyper, den cytosoliske hyperreplikasjonen og den intravacuolære langsomme replikasjonen i Salmonella-holdige vakuoler (SCVer). Den cytosoliske hyperreplikasjonen induserer inflammatorisk vertscelledød og Salmonella-ekstrudering i tarmlumen3; Den vakuolære replikasjonen fører til transepitelpenetrasjon og systemisk spredning4. Derfor påvirker omfanget av invasjon og vacuolar vs. cytosolisk replikasjon infeksjonsforløpet.
Slekten Salmonella er svært variert, inkludert tusenvis av serotyper med forskjellige vertsområder og evner til å forårsake sykdom. For eksempel S. Typhimurium er definert som en generalist serovar, fordi den infiserer flere ikke-relaterte verter, og representerer en av de viktigste årsakene til human salmonellose. Annerledes, S. Derby regnes som en svintilpasset serovar, da den for det meste er isolert fra svinet, men det er også rapportert i topp fem av serovarene som er ansvarlige for menneskelig infeksjon1. Imidlertid er kunnskap om bakteriell oppførsel inne i epitelceller i hovedsak begrenset til studiet av noen få referansestammer, som S. Typhimurium SL1344, som ikke representerer det store naturlige mangfoldet av Salmonella patogenitet. Karakterisering av samspillet mellom forskjellige stammer av Salmonella med epitelceller vil bidra til å forstå deres forskjellige patogenitet. Av denne grunn ble en fluorescensmikroskopibasert protokoll med høy gjennomstrømning utviklet for å analysere den intracellulære oppførselen til et stort antall stammer på en rask og i stor grad automatisert måte. I denne protokollen ble infeksjon av epitelceller utført i 96-brønns bildeplater og bildeinnsamling ble gjort ved hjelp av et automatisert fluorescensmikroskop. pCHAR-Duo-plasmidet ble brukt til å observere invasjons- og replikasjonsfenotyper av Salmonella inne i epitelceller gjennom fluorescerende mikroskopi5. Dette plasmidet bærer genet som koder for den røde fluorescerende reporteren mCherry, konstitutivt uttrykt av alle de transformerte bakteriecellene, og genet som koder for den grønne fluorescerende reporteren GFP, hvis uttrykk aktiveres av glukose-6-fosfat som utelukkende er tilstede i cytosolen av eukaryote celler og fraværende i SCVer. Derfor tillater plasmidet diskriminering mellom vakuolære og cytosoliske bakterier ved differensiell ekspresjon av mCherry- og GFP-reportere.
De vakuolære og cytosoliske bakteriene på mikroskopibilder kvantifiseres vanligvis ved manuell skåring6, men dette er en tidkrevende metode som begrenser analysen til et lite antall prøver. Derfor ble to komplementære og automatiserte bildeanalyser utviklet områdeanalyse og enkeltcelleanalyse ved hjelp av ImageJ7, en fritt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare. Områdeanalysen måler den totale intracellulære bakteriebelastningen og omfanget av cytosolisk hyperreplikasjon ved å bruke data fra områder okkupert av epitelceller, røde og grønne Salmonellae i hvert ervervet mikroskopibilde. Denne metoden kan brukes på bilder oppnådd ved lav forstørrelse; Derfor tillater det å score et høyt antall epitelceller med få bilder, noe som forkorter oppkjøpstiden. Enkeltcelleanalysen bruker cellesegmentering for å bestemme prosentandelen infiserte celler, gjennomsnittlig vakuolær belastning og prosentandelen infiserte celler som gjennomgår cytosolisk hyperreplikasjon med enkeltcelleoppløsning.
I denne protokollen er alle trinnene i bildeanalysen beskrevet i detalj for å bli utført manuelt, men den samme analysen kan automatiseres av våre spesialdesignede ImageJ-skript. Disse skriptene tillater også å kjøre batchanalyser for automatisk å analysere flere bilder og dermed øke hastigheten på utførelsen av metoden.
Måten Salmonella koloniserer tarmepitelceller, påvirker infeksjonsresultatet. Ved invasjon induserer den cytosoliske hyperreplikasjonen betennelse i tarmen3, mens vacuolar replikasjon kan føre til systemisk spredning4. Salmonellastammer kan variere i deres evne til å invadere og replikere inne i tarmepitelceller9. Faktisk er Salmonella en ekstremt mangfoldig slekt som består av mer enn 2,500 serovarer, som har forskjellige evner til å forårsake sykdom. I tillegg er Salmonella den hyppigst rapporterte årsaken til matbårne utbrudd i EU, noe som indikerer en stor spredning i den menneskelige befolkningen1. Derfor er tilgjengeligheten av pålitelige, høykapasitetsmetoder for kvantifisering av de intracellulære fenotypene av Salmonella av stor betydning for å evaluere forskjeller i virulens blant et stort antall Salmonella-stammer og til slutt tillate en nøyaktig og belastningsspesifikk risikovurdering av dette patogenet.
Protokollen beskrevet her måler oppførselen til Salmonella inne i epitelceller på en rask og automatisert måte. Infeksjonen av epitelceller utføres i 96-brønns avbildningsmikroplater, og et automatisert fluorescensmikroskop brukes til bildeopptak, noe som gjør protokollen egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømning. Denne protokollen utnytter pCHAR-Duo-plasmidet, som gjør det mulig å skille vacuolar fra cytosolisk Salmonellae gjennom differensialuttrykket til to fluorescerende reportere5. De intracellulære fenotypene av Salmonella analyseres ofte ved manuell scoring, en tidkrevende prosedyre som er uegnet for analyse av et stort antall stammer og cellekulturer per stamme og utsatt for operatørens feil og variasjon mellom operatører. For å overvinne disse begrensningene ble det utviklet to komplementære og automatiserte bildeanalyser, områdeanalysen og enkeltcelleanalysen. ImageJ, en fritt tilgjengelig programvare, ble brukt til å utvikle de to analysene. For å akselerere protokollutførelsen leveres ImageJ-skript for satsvis analyse av flere anskaffelsesfiler uten operatørintervensjon som tilleggsfiler.
Områdeanalysen ble designet for å kvantifisere, i noen få trinn, den totale koloniseringen av epitelceller (infeksjonsforhold) og hyperreplikasjonsnivået (hyperreplikasjonsforholdet) gjennom måling av områdene som er spesielt okkupert av kjernene i epitelceller og ved Salmonellae som uttrykker enten mCherry eller mCherry sammen med GFP. Områdeanalysen brukes på bilder oppnådd ved lav forstørrelse, hvor både vakuolar og hyperreplikerende Salmonellae er i fokus i samme z-plan, og et stort antall epitelceller vises per mikroskopisk felt, noe som reduserer størrelsen og antall oppkjøpsfiler. Områdeanalysen muliggjør en automatisert, rask og beregningsmessig lett analyse av et stort antall prøver, noe som gjør den egnet for analyser med høy gjennomstrømning som screeningeksperimenter.
Enkeltcelleanalysen ble designet for å kvantifisere Salmonella-fenotyper inne i epitelceller med enkeltcelleoppløsning, oppnådd gjennom cellesegmentering og måling av det cellulære området og prosentandelen av areal okkupert av vakuolar og cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae. Den totale koloniseringen av epitelceller karakterisert gjennom områdeanalysen er her brutt ned i tre kvantitative parametere, prosentandelen infiserte celler, gjennomsnittlig vakuolær belastning og hyperreplikasjonshastigheten, noe som gjør det mulig å evaluere og kvantifisere bidraget fra hver fenotype til den totale koloniseringen, og utfyller derfor resultatene av områdeanalysen. De større detaljene som tilbys av enkeltcelleanalysen kommer på bekostning av langsommere bildeoppkjøp og analyse. Faktisk, for å oppnå enkeltcelleoppløsning, utføres bildeoppkjøp ved høy forstørrelse. Dette innebærer at det er behov for flere z-plan for å observere både vakuolære og cytosoliske Salmonellae i fokus, og at innsamling av et stort antall felt per prøve er nødvendig for å score et høyt antall epitelceller, og dermed forlenge innsamlingstiden sammenlignet med områdeanalyse. Videre er analysen av flere store anskaffelsesfiler beregningskrevende, og krever dermed en passende arbeidsstasjon (en 6-kjerners, 32 GB RAM-arbeidsstasjon ble brukt). Derfor kan enkeltcelleanalyse brukes som frittstående i begrensede gjennomstrømningsforhold eller som en andrenivåmetode koblet til områdeanalysen for å få en dypere forståelse av Salmonella-fenotypene i epitelceller.
De to komplementære analysene ble validert ved bruk av S. Tm, S. Derby wt, og S. Derby ΔsipA, valgt fordi deres oppførsel inne i epitelceller allerede var kjent for å variere når det gjelder invasjon eller replikasjon 9,10. Resultatene fra areal- og encelleanalysene viser at protokollen tillot kvantitativt å skille forskjeller i intracellulære Salmonella-fenotyper i samsvar med egenskapene til de testede stammene. Videre viser disse resultatene at enkeltcelleanalysen tillater kvantifisering av bidraget fra hver intracellulær fenotype (invasjon, vakuolær belastning og cytosolisk replikasjon) til den totale koloniseringsskåren ved hjelp av områdeanalysen.
Denne protokollen ble brukt her for å studere in vitro patogenitet av forskjellige stammer av Salmonella, men det kan ha andre anvendelser som studiet av tilfeldige mutanter for å identifisere gener involvert i invasjonen og / eller replikasjon i epitelceller. I tillegg kan protokollen tilpasses for å analysere oppførselen til Salmonella inne i andre cellelinjer enn INT407-celler. Det kan også brukes som utgangspunkt for å utvikle lignende metoder for å studere cellepatogeninteraksjon av andre intracellulære mikroorganismer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Olivia Steele-Mortimer for å dele pCHAR-Duo plasmid. Dette arbeidet ble finansiert av det italienske helsedepartementet, tilskudd PRC2019014 og PRC2021004.
96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |