Salmonella, hem Salmonella’ya özgü vakuollerde hem de sitosolde serbest (hiper-replikasyon) bağırsak epitel hücrelerinin içinde istila eder ve çoğalır. Burada, Salmonella’nın hücre içi fenotiplerini ImageJ aracılığıyla iki tamamlayıcı görüntü analizi ile ölçmek, tek hücreli çözünürlüğe ve puanlamaya ulaşmak için yüksek verimli floresan mikroskopi tabanlı bir protokol açıklanmaktadır.
Salmonella, bağırsak epitelini istila edebilen ve enterositlerde hem Salmonella’ya özgü vakuollerin içinde hem de sitozolde serbest (sitozolik hiper-replikasyon) çoğalabilen enterik bir patojendir. Hücre içi replikasyonun bu farklı fenotipleri patogenezin farklı yolaklarına yol açar, yani sitozolik hiper-replikasyon inflamatuar hücre ölümünü ve bağırsak lümenine ekstrüzyonu indüklerken, vakuolar replikasyon transepitel penetrasyonuna ve sistemik yayılmaya yol açar. mCherry ve GFP’nin diferansiyel ekspresyonu ile vakuoler ve sitozolik bakteriler arasında ayrıma izin veren pCHAR-Duo floresan muhabir plazmidi gibi istila edilmiş hücreler içindeki Salmonella’nın davranışını incelemek için mikroskopi araçları oluşturmak için önemli çaba sarf edilmiştir. Bununla birlikte, hücre içi fenotipler genellikle manuel olarak puanlanır, analizi az sayıda örnek ve hücreyle sınırlayan zaman alıcı bir prosedürdür. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, serbestçe kullanılabilen bir görüntü analiz yazılımı olan ImageJ kullanılarak iki tamamlayıcı ve otomatik görüntü analizi geliştirilmiştir. Yüksek verimli protokolde, epitel hücreleri, 96 delikli plakalar kullanılarak pCHAR-Duo taşıyan Salmonella ile enfekte edildi. Görüntüleme otomatik floresan mikroskobu kullanılarak yapıldı. Daha sonra, Salmonella’nın hücre içi davranışını farklı detay seviyelerinde ölçmek için iki görüntü analiz yöntemi uygulandı. İlk yöntem, genel hücre içi bakteri yükünü ve sitozolik hiper-replikasyonun derecesini ölçer. Hızlıdır ve çok sayıda hücre ve numunenin puanlanmasına izin verir, bu da tarama deneyleri gibi yüksek verimli testler için uygun hale getirir. İkinci yöntem, enfekte hücrelerin yüzdesini, Salmonella’nın ortalama vakuolar yükünü ve epitel hücreleri içindeki Salmonella davranışı hakkında daha fazla ayrıntı veren sitozolik hiper-replikasyon oranını belirlemek için tek hücreli analiz gerçekleştirir. Protokoller, Salmonella-enterosit etkileşiminin ana adımlarının toplu analizlerini otomatik olarak çalıştırmak için özel olarak tasarlanmış ImageJ komut dosyaları tarafından gerçekleştirilebilir.
Salmonella, Avrupa Birliği’nde gıda kaynaklı hastalık salgınlarına neden olan en sık bildirilen bakteriyel ajandır1. Salmonella enfeksiyonunun birincil patolojik belirtisi, yutulmayı takiben bağırsaktaki patojen davranışın ve bunun sonucunda ortaya çıkan lokal enflamatuar yanıtın sonucu olan enterittir2. Bununla birlikte, Salmonella ayrıca ekstra-intestinal bölgelere yayılabilir ve özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış bireylerde sistemik enfeksiyona neden olabilir. Salmonella ve bağırsak epiteli arasındaki etkileşim tipi, enfeksiyonun sonucunu şartlandırır. Bağırsak lümenine girdikten sonra, Salmonella bağırsak epitel hücrelerinin içinde istila eder ve çoğalır. Hücre içi düzeyde, Salmonella iki farklı replikasyon fenotipi, sitozolik hiper-replikasyon ve Salmonella içeren vakuoller (SCV’ler) içinde intravakuoler yavaş replikasyon sunabilir. Sitozolik hiper-replikasyon, inflamatuar konakçı hücre ölümünü ve bağırsak lümenine Salmonella ekstrüzyonunu indükler3; vakuolar replikasyon transepitel penetrasyonuna ve sistemik yayılıma yol açar4. Bu nedenle, invazyon ve vakuolar ve sitozolik replikasyonun derecesi enfeksiyonun seyrini etkiler.
Salmonella cinsi, farklı konakçı aralıklarına ve hastalığa neden olma yeteneklerine sahip binlerce serotip de dahil olmak üzere çok çeşitlidir. Örneğin, S. Typhimurium, genelci bir serovar olarak tanımlanır, çünkü birden fazla ilgisiz konağı enfekte eder ve insan salmonellozunun ana nedenlerinden birini temsil eder. Farklı olarak, S. Derbi, çoğunlukla domuzdan izole edildiği için domuz adaptasyonlu bir serovar olarak kabul edilir, ancak aynı zamanda insan enfeksiyonundan sorumlu serovarların ilk beşinde de bildirilmiştir1. Bununla birlikte, epitel hücrelerinin içindeki bakteriyel davranış hakkındaki bilgi, esasen S olarak birkaç referans suşunun incelenmesiyle sınırlıdır. Typhimurium SL1344, Salmonella patojenitesinin geniş doğal çeşitliliğini temsil etmez. Farklı Salmonella suşlarının epitel hücreleri ile etkileşimini karakterize etmek, farklı patojenitelerinin anlaşılmasına katkıda bulunacaktır. Bu nedenle, çok sayıda suşun hücre içi davranışını hızlı ve büyük ölçüde otomatik bir şekilde analiz etmek için yüksek verimli floresan mikroskopi tabanlı bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokolde 96 delikli görüntüleme plakalarında epitel hücrelerinin enfeksiyonu gerçekleştirilmiş ve otomatik floresan mikroskobu kullanılarak görüntü elde edilmiştir. pCHAR-Duo plazmid, floresan mikroskopi5 ile epitel hücreleri içindeki Salmonella’nın invazyon ve replikasyon fenotiplerini gözlemlemek için kullanıldı. Bu plazmid, dönüştürülmüş tüm bakteri hücreleri tarafından yapısal olarak eksprese edilen kırmızı floresan muhabir mCherry’yi kodlayan geni ve ekspresyonu sadece ökaryotik hücrelerin sitosolünde bulunan ve SCV’lerde bulunmayan glikoz-6-fosfat tarafından aktive edilen yeşil floresan muhabir GFP’yi kodlayan geni taşır. Bu nedenle, plazmid, mCherry ve GFP muhabirlerinin diferansiyel ekspresyonu ile vakuoler ve sitozolik bakteriler arasında ayrım yapılmasına izin verir.
Mikroskopi görüntülerindeki vakuolar ve sitozolik bakteriler genellikle manuel puanlama6 ile ölçülür, ancak bu, analizi az sayıda numuneyle sınırlayan zaman alıcı bir yöntemdir. Bu nedenle, ücretsiz olarak kullanılabilen bir görüntü analiz yazılımı olan ImageJ7 kullanılarak iki tamamlayıcı ve otomatik görüntü analizi geliştirildi – alan analizi ve tek hücreli analiz. Alan analizi, elde edilen her mikroskopi görüntüsünde epitel hücreleri, kırmızı ve yeşil Salmonellae tarafından işgal edilen alanların verilerini kullanarak genel hücre içi bakteri yükünü ve sitozolik hiper-replikasyonun derecesini ölçer. Bu yöntem düşük büyütme ile elde edilen görüntülere uygulanabilir; bu nedenle, az sayıda görüntüyle çok sayıda epitel hücresinin puanlanmasına izin vererek edinme süresini kısaltır. Tek hücreli analiz, enfekte hücrelerin yüzdesini, ortalama vakuolar yükü ve tek hücreli çözünürlükte sitozolik hiper-replikasyon geçiren enfekte hücrelerin yüzdesini belirlemek için hücre segmentasyonunu kullanır.
Bu protokolde, görüntü analizinin tüm adımları manuel olarak gerçekleştirilmek üzere ayrıntılı olarak açıklanmıştır, ancak aynı analiz özel olarak tasarlanmış ImageJ komut dosyalarımız tarafından otomatikleştirilebilir. Bu komut dosyaları ayrıca birden fazla görüntüyü otomatik olarak analiz etmek için toplu analizler çalıştırmaya izin verir ve böylece yöntemin yürütülmesini hızlandırır.
Salmonella’nın bağırsak epitel hücrelerini kolonize etme şekli, enfeksiyon sonucunu etkiler. İnvazyon üzerine, sitozolik hiper-replikasyon bağırsak iltihabını indükler3, oysa vakuoler replikasyon sistemik yayılmaya yol açabilir4. Salmonella suşları, bağırsak epitel hücrelerinin içinde istila etme ve çoğalma yeteneklerine göre değişebilir9. Gerçekten de, Salmonella, hastalığa neden olmak için farklı yeteneklere sahip 2.500’den fazla serovardan oluşan son derece çeşitli bir cinstir. Ek olarak, Salmonella, Avrupa Birliği’nde gıda kaynaklı salgınların en sık bildirilen nedenidir ve insan popülasyonunda büyük bir yayılmaya işaret etmektedir1. Bu nedenle, Salmonella’nın hücre içi fenotiplerinin nicelleştirilmesi için güvenilir, yüksek verimli yöntemlerin mevcudiyeti, çok sayıda Salmonella suşu arasındaki virülans farklılıklarını değerlendirmek ve sonuçta bu patojenin doğru ve suşa özgü bir risk değerlendirmesine izin vermek için büyük önem taşımaktadır.
Burada açıklanan protokol, Salmonella’nın epitel hücreleri içindeki davranışını hızlı ve otomatik bir şekilde ölçer. Epitel hücrelerinin enfeksiyonu 96 kuyucuklu görüntüleme mikroplakalarında gerçekleştirilir ve görüntü elde etmek için otomatik floresan mikroskobu kullanılır, bu da protokolü yüksek verimli uygulamalar için uygun hale getirir. Bu protokol, iki floresan muhabirin diferansiyel ekspresyonu yoluyla vakuolar’ın sitozolik Salmonella’dan ayırt edilmesini sağlayan pCHAR-Duo plazmidinden yararlanır5. Salmonella’nın hücre içi fenotipleri genellikle suşun başına çok sayıda suşun ve hücre kültürünün analizi için uygun olmayan ve operatör hatalarına ve operatörler arası varyasyona eğilimli olan zaman alıcı bir prosedür olan manuel puanlama ile analiz edilir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, alan analizi ve tek hücre analizi olmak üzere iki tamamlayıcı ve otomatik görüntü analizi geliştirilmiştir. Serbestçe kullanılabilen bir yazılım olan ImageJ, iki analizi geliştirmek için kullanıldı. Protokol yürütmeyi hızlandırmak için, operatör müdahalesi olmadan birden fazla edinme dosyasının toplu analizi için ImageJ komut dosyaları ek dosyalar olarak sağlanır.
Alan analizi, birkaç adımda, epitel hücrelerinin çekirdekleri tarafından özel olarak işgal edilen alanların ölçümü ve GFP ile birlikte mCherry veya mCherry eksprese eden Salmonellae ile epitel hücrelerinin genel kolonizasyonunu (enfeksiyon oranı) ve hiper-replikasyon seviyesini (hiper-replikasyon oranı) ölçmek için tasarlanmıştır. Alan analizi, hem vakuolar hem de hiper-replikasyon yapan Salmonellae’nin aynı z-düzleminde odaklandığı düşük büyütmede elde edilen görüntülere uygulanır ve mikroskobik alan başına çok sayıda epitel hücresi görüntülenerek edinme dosyalarının boyutunu ve sayısını azaltır. Alan analizi, çok sayıda numunenin otomatik, hızlı ve hesaplama açısından hafif bir analizine izin vererek tarama deneyleri gibi yüksek verimli testler için uygun hale getirir.
Tek hücreli analiz, hücre segmentasyonu ve hücresel alanın ölçümü ve vakuoler ve sitozolik hiper-replikasyon Salmonella’nın kapladığı alan yüzdesi ile elde edilen tek hücreli çözünürlüğe sahip epitel hücreleri içindeki Salmonella fenotiplerini ölçmek için tasarlanmıştır. Alan analizi ile karakterize edilen epitel hücrelerinin genel kolonizasyonu burada üç kantitatif parametreye, enfekte olmuş hücrelerin yüzdesine, ortalama vakuolar yüke ve hiper-replikasyon hızına bölünür, bu nedenle her bir fenotipin genel kolonizasyona katkısını değerlendirmeyi ve nicelleştirmeyi sağlar, bu nedenle alan analizinin sonuçlarını tamamlar. Tek hücreli analizin sunduğu daha büyük ayrıntılar, daha yavaş görüntü elde etme ve analiz pahasına gelir. Aslında, tek hücreli çözünürlük elde etmek için, görüntü yakalama yüksek büyütmede gerçekleştirilir. Bu, hem vakuolar hem de sitozolik Salmonella’yı odakta gözlemlemek için çoklu z-düzlemlerine ihtiyaç duyulduğunu ve çok sayıda epitel hücresinin puanlanması için numune başına çok sayıda alanın elde edilmesinin gerekli olduğunu ve böylece alan analizine kıyasla edinim süresini uzattığını ima eder. Ayrıca, birkaç büyük edinme dosyasının analizi hesaplama açısından zorlayıcıdır, bu nedenle uygun bir iş istasyonu gerektirir (6 çekirdekli, 32 GB RAM iş istasyonu kullanılmıştır). Bu nedenle, tek hücreli analiz, sınırlı verim koşullarında tek başına veya epitel hücrelerinin içindeki Salmonella fenotiplerinin daha derin bir anlayışını elde etmek için alan analizine bağlı ikinci düzey bir yöntem olarak kullanılabilir.
İki tamamlayıcı analiz S kullanılarak doğrulandı. Tm, S. Derby wt ve S. Derby ΔsipA, epitel hücreleri içindeki davranışlarının invazyon veya replikasyon açısından farklı olduğu zaten bilindiği için seçildi 9,10. Alan ve tek hücreli analizlerin sonuçları, protokolün, test edilen suşların özelliklerine uygun olarak hücre içi Salmonella fenotiplerindeki farklılıkları nicel olarak ayırt etmesine izin verdiğini göstermektedir. Ayrıca, bu sonuçlar, tek hücreli analizin, her hücre içi fenotipin (invazyon, vakuolar yük ve sitozolik replikasyon) alan analizi kullanılarak puanlanan genel kolonizasyona katkısının nicelleştirilmesine izin verdiğini göstermektedir.
Bu protokol burada farklı Salmonella suşlarının in vitro patojenitesini incelemek için uygulanmıştır, ancak epitel hücreleri içindeki istila ve / veya replikasyonda rol oynayan genleri tanımlamak için rastgele mutantların incelenmesi gibi başka uygulamalara da sahip olabilir. Ek olarak, protokol, Salmonella’nın INT407 hücrelerinden diğer hücre hatları içindeki davranışını analiz etmek için uyarlanabilir. Ayrıca, diğer hücre içi mikroorganizmaların hücre-patojen etkileşimini incelemek için benzer yöntemler geliştirmek için başlangıç noktası olarak da kullanılabilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, pCHAR-Duo plazmidini paylaştığı için Dr. Olivia Steele-Mortimer’e teşekkür eder. Bu çalışma İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından finanse edildi, PRC2019014 ve PRC2021004 hibe edildi.
96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |